米非司酮對子宮巨噬細胞活化的作用及機制研究.pdf

1、藥物避孕是婦女避孕史上的里程碑。自上世紀60年代以來，甾體激素類口服避孕藥(Oral contraceptives，OCs)，已在全球得到了廣泛的應用。但是由于口服避孕藥含有雌激素，存在導致血栓性疾病、激素依賴性腫瘤及體重增加等副作用，限制了它的使用;而單純孕激素類避孕藥又由于存在不規(guī)則陰道流血及月經周期控制欠佳等缺點，影響了它在臨床上的應用。因此開發(fā)和研制新一代口服避孕藥，避免和減少上述的這些不良反應迫在眉睫。米非司酮是一種具有強效的

2、抗孕激素受體和抗糖皮質激素受體特性的合成19-去甲睪酮衍生物，自其合成以來在臨床上得到廣泛應用，包括婦產科學、腫瘤學、免疫學及內分泌學等。目前，米非司酮也是一種在無保護性生活之后、高效的緊急避孕方法，并且已經有研究認為其有潛力成為新型的、副作用極少的長期口服避孕藥;研究已經表明米非司酮并不直接對胚胎產生不利影響，但可通過作用于內膜來防止胚胎種植而又不影響排卵，從而實現(xiàn)“內膜避孕”。但是，米非司酮避孕的確切作用機制仍有待進一步闡明。巨噬細

3、胞是可塑性最強的免疫細胞，存在于所有組織中，并且可以根據它們所處微環(huán)境的變化而改變其功能。由于在人類的子宮內膜中幾乎沒有樹突狀細胞，巨噬細胞就成為了最主要的抗原呈遞細胞。子宮巨噬細胞可能在胚胎成功植入所需的幾個過程中發(fā)揮關鍵作用，包括子宮內膜的重塑、相鄰免疫細胞的免疫調節(jié)、滋養(yǎng)細胞侵襲和胎兒-母體免疫耐受的調節(jié)等。深入認識和探索米非司酮確切的避孕機理可能為新型避孕藥的開發(fā)和研制提供科學依據。
　　第一部分子宮巨噬細胞在基礎狀態(tài)下為

4、M2型巨噬細胞
　　目的:
　　明確子宮巨噬細胞在基礎狀態(tài)下的活化表型。
　　方法:
　　從早孕期婦女外周血分離單核細胞，體外分別誘導分化成經典活化(M1)型巨噬細胞及替代活化(M2)型巨噬細胞;同時從早孕期蛻膜組織分離、培養(yǎng)得到高純度的子宮巨噬細胞，在顯微鏡下觀察子宮巨噬細胞的形態(tài)，采用流式細胞術檢測子宮巨噬細胞的CD14+表面標記。采用ELISA檢測子宮巨噬細胞培養(yǎng)的上清液中的細胞因子IL-12p70、IL-

5、23、 IL-p40及IL-10的表達水平，將其分別與M1型巨噬細胞及M2型巨噬細胞分泌的相應的細胞因子相比較。
　　結果:
　　在本研究中，我們采用免疫磁珠分選法成功分離到了高純度的子宮巨噬細胞（90％以上）;與M1型巨噬細胞相比，子宮巨噬細胞分泌的抗炎因子IL-10水平明顯更高，表達的促炎因子IL-12p70、IL-23和IL-p40水平明顯低下，而子宮巨噬細胞與M2巨噬細胞表達的細胞因子相似，即高IL-10水平和低IL

6、-12p70，IL-23和IL-p40水平。
　　結論:
　　子宮巨噬細胞在基礎狀態(tài)下呈現(xiàn)M2表型，這可能有利于胚胎種植及妊娠的發(fā)展。
　　第二部分米非司酮通過糖皮質激素受體拮抗作用促進M1型巨噬細胞活化
　　目的:
　　明確米非司酮對子宮巨噬細胞活化的作用及途徑。
　　方法:
　　將體外分選到的高純度子宮巨噬細胞采用不同濃度的米非司酮、米非司酮+孕酮、米非司酮+地塞米松進行處理。采用ELISA

7、檢測米非司酮、米非司酮+孕酮、米非司酮+地塞米松對子宮巨噬細胞活化的影響。采用MTT檢測米非司酮對子宮巨噬細胞活力的影響。
　　結果:
　　與未處理的子宮巨噬細胞相比，經低劑量米非司酮處理的子宮巨噬細胞產生的IL-12p70、IL-23和IL-p40明顯增加，而IL-10的表達水平卻明顯降低;并且與經65nmol/L米非司酮處理的子宮巨噬細胞相比，經200 nmol/L米非司酮處理的子宮巨噬細胞明顯產生更多的IL-12p70

8、、IL-23和IL-12p40，而抑制IL-10產生的作用更加明顯。經低劑量米非司酮處理的巨噬細胞與未經處理的巨噬細胞之間的細胞活力沒有顯著性差異。與經200nmol/L米非司酮處理的巨噬細胞相比，孕酮對200nmol/L米非司酮誘導巨噬細胞產生的高IL-12p70、IL-23、IL-p40表達沒有影響，而且不影響200nmol/L米非司酮對巨噬細胞IL-10表達的抑制。地塞米松能明顯抑制200nmol/L米非司酮誘導巨噬細胞產生的IL

9、-12p70、IL-23和IL-12p40的表達水平，同時能逆轉200nmol/L米非司酮對巨噬細胞IL-10表達的抑制。
　　結論:
　　米非司酮通過糖皮質激素受體拮抗作用促進子宮巨噬細胞從M2型向M1型轉化，從而有可能增強Th1免疫應答而抑制Th2免疫應答，最終導致胚胎植入失敗，這可能是其避孕機理之一。
　　第三部分米非司酮通過激活TAK1促進M1型巨噬細胞活化
　　目的:
　　明確米非司酮對子宮巨噬細

10、胞活化的分子機制。
　　方法:
　　將體外分選到的高純度子宮巨噬細胞采用200 nmol/L米非司酮、200 nmol/L米非司酮和6umol/L地塞米松進行處理。采用蛋白免疫印跡法檢測NFκβ、p38MAPK、ERK、JNK及TAK1蛋白磷酸化水平的變化。分別采用NFκβ、p38 MAPK及TAK1特異性抑制劑JSH-23、SB203580及5Z-7-oxozeaenol檢測其對米非司酮介導的M1型巨噬細胞活化的影響。

11、r>　　結果:
　　經200nmol/L米非司酮處理的子宮巨噬細胞Iκβα的磷酸化明顯增加，6umol/L地塞米松能明顯抑制這一作用。與抑制米非司酮介導Iκβα磷酸化一致，地塞米松也能抑制米非司酮介導的Iκβa降解。另外，地塞米松抑制了米非司酮介導的磷酸化p65的細胞內核轉位。經200nmol/L米非司酮處理的子宮巨噬細胞p38 MAPK的磷酸化明顯增加，地塞米松能明顯抑制這一作用。JSH-23能明顯抑制米非司酮誘導的IL-12p

12、70、IL-23和IL-12p40的表達水平，但是JSH-23并不能增加IL-10的表達水平。SB203580抑制p38MAPK激活后對米非司酮誘導的經典巨噬細胞活化沒有影響。經200nmol/L米非司酮處理的子宮巨噬細胞TAK1的磷酸化明顯增加，地塞米松能明顯抑制這一作用。5Z-7-oxozeaenol能明顯抑制米非司酮誘導的NFκβ活化，并且明顯抑制IL-12p70、IL-23和IL-12p40的產生，同時能明顯增加IL-10的表達