裂殖壺菌脂肪酸合成相關(guān)蛋白過表達(dá)菌株的構(gòu)建和酶法破壁提取油脂工藝的研究.pdf

1、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)屬于n-3多不飽和脂肪酸(PUFA)，能夠促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，對視覺和智力發(fā)育具有重要意義，此外還具有抑癌、抗炎、保護(hù)心腦血管等多方面的生物活性。裂殖壺菌（Aurantiochytriumlimacinum）是一種海洋真菌，其胞內(nèi)油脂含量超過細(xì)胞干重的50％，DHA含量豐富，兼具安全質(zhì)優(yōu)、無毒易培養(yǎng)等優(yōu)點，在健康保健和養(yǎng)殖飼料領(lǐng)域日益受到關(guān)注。本文主要從酶法破壁提取裂殖壺

2、菌胞內(nèi)油脂條件的優(yōu)化、裂殖壺菌脂肪酸合成相關(guān)基因的克隆及構(gòu)建超表達(dá)菌株等方面展開研究，為進(jìn)一步提高裂殖壺菌的油脂含量及工業(yè)提取裂殖壺菌胞內(nèi)油脂打下基礎(chǔ)。
　　本文以裂殖壺菌Aurantiochytrium limacinum OUC168為研究對象，比較了酶法、超聲和索氏提取三種方法的油脂和DHA提取效率;其中主要研究了不同酶在不同條件下的破壁效率，結(jié)果顯示，破壁效率由高到低分別是木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞纖維素酶＞葡聚

3、糖酶和蝸牛酶＞溶菌酶。選取木瓜蛋白酶，中性蛋白酶和纖維素酶，并結(jié)合各破壁條件進(jìn)行正交實驗，確定了單酶的最優(yōu)酶解條件為:木瓜蛋白酶，4000U/ml，pH6.5，45℃，4h，進(jìn)一步將中性蛋白酶添加到酶切體系中組成復(fù)合酶，可以使酶解后的油脂提取率進(jìn)一步提高，達(dá)56.37±1.41％，DHA提取率為12.82±0.66％;超聲破碎法油脂提取率為58.2±3.91％，DHA提取率為12.02±2.09％;索氏提取法油脂提取率為61.42±1.

4、90％，DHA提取率為12.06±0.74％。在油脂提取方面，索氏提取法破壁效率最高，其次為超聲破碎法，最后為酶法;在DHA提取方面，酶法破壁效果最好，其次為索氏提取法，最后為超聲破碎法。
　　?；d體蛋白(ACP)是裂殖壺菌脂肪酸合成過程中的重要蛋白，本文克隆了裂殖壺菌的acp基因，分析發(fā)現(xiàn)acp基因有1個開放閱讀框，編碼由152個氨基酸組成的?；d體蛋白(ACP)，通過預(yù)測，此蛋白分子質(zhì)量約為16.44kDa，等電點5.63。

5、ACP在PKS途徑中是一種關(guān)鍵蛋白，主要作為脂肪酸合成過程中的酯?；d體，蛋白的活性位點一般位于第37位的絲氨酸殘基，其上具有磷酸泛酰巰基乙胺基結(jié)合位點。在脂肪酸合成過程中，?；d體蛋白與輔基結(jié)合，作為載體將輔基結(jié)合到新生成的脂肪酸上，接著在酮酯酰-ACP合成酶、酮酯酰-ACP還原酶、烯酯酰-ACP脫水異構(gòu)酶和烯酯酰-ACP還原酶等的催化作用下，合成多不飽和脂肪酸。
　　酮酯酰-酰基載體蛋白還原酶(KR)、脫水異構(gòu)酶(DH)也是裂

6、殖壺菌脂肪酸合成過程中的重要酶，由本實驗室前期克隆獲得，并構(gòu)建了表達(dá)載體p18SZPC-KR-Cm、p18SZPC-DH-Cm。本研究構(gòu)建了含有acp基因的表達(dá)載體p18SZPC-ACP-Cm，分別將上述3個載體轉(zhuǎn)化入裂殖壺菌，通過篩選和檢測，得到基因超表達(dá)菌株，生物性狀分析結(jié)果顯示，各轉(zhuǎn)化菌株的生物量大于出發(fā)菌株，KR+轉(zhuǎn)化株生物量為19.69±2.36 g/l;其次依次為ACP+轉(zhuǎn)化株的19.02±2.27g/l;DH+轉(zhuǎn)化株的18

7、.73±0.83g/l;未轉(zhuǎn)化菌株的生物量最低，為17.81±0.90 g/l。3種轉(zhuǎn)化菌株的油脂含量和DHA積累量具有顯著提高，尤其是KR+和ACP+轉(zhuǎn)化菌株，KR+轉(zhuǎn)化株油脂含量達(dá)到48.07±4.31％;其次依次為ACP+轉(zhuǎn)化株的42.64±2.64％; DH+轉(zhuǎn)化株的39.00±5.00％;未轉(zhuǎn)化菌株的油脂含量最低，為36.24±3.76％。DHA結(jié)果顯示，KR+轉(zhuǎn)化菌株總DHA含量為8.47±2.26％，高于ACP+轉(zhuǎn)化株的7