裂殖壺菌培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化及PKS酶域過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建.pdf_第1頁(yè)
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1、裂殖壺菌(Aurantiochytrium limacinum)又稱裂壺藻,是一種海洋真菌,細(xì)胞內(nèi)含有大量的油脂,其中二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,簡(jiǎn)稱DHA)含量最多。DHA是一種是重要的n-3多不飽和脂肪酸,能促進(jìn)嬰幼兒大腦和視網(wǎng)膜的發(fā)育及成熟,并且對(duì)老年人降低血脂、預(yù)防心血管疾病等有明顯作用。由于裂殖壺菌容易培養(yǎng),生長(zhǎng)速度快,并且細(xì)胞內(nèi)的DHA含量高等優(yōu)點(diǎn),成為微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA的優(yōu)良菌種。本論文從裂

2、殖壺菌培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化、聚酮合酶(PKS)基因的克隆以及轉(zhuǎn)化等方面進(jìn)行研究,為降低裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的成本,提高裂殖壺菌生物量、DHA含量奠定基礎(chǔ)。
  實(shí)驗(yàn)室前期成功實(shí)現(xiàn)了豆粕水解物做裂殖壺菌發(fā)酵中的氮源,替代了酵母提取物,降低了生產(chǎn)成本,但是豆粕水解液的制備需要酸解,易腐蝕設(shè)備,而且操作繁瑣。因此迫切要求尋找適宜的廉價(jià)氮源以滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。本研究以裂殖壺菌Aurantiochytrium limacinum OUC168

3、為實(shí)驗(yàn)菌株,首次以玉米漿干粉做氮源進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),結(jié)果裂殖壺菌在以酵母提取物(20g/L)做氮源的培養(yǎng)基上生物量為4.40 g/L·d,DHA含量是8.95%;在玉米漿干粉(20g/L)做氮源的培養(yǎng)基上生物量是4.13g/L·d,DHA含量是8.72%,由于玉米漿干粉的價(jià)格是酵母提取物的十分之一,在生物量和DHA含量差幅不大的情況下,大大降低了發(fā)酵生產(chǎn)的成本,對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)有重要意義。進(jìn)一步以玉米漿干粉、谷氨酸鈉、葡萄糖這三個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試

4、驗(yàn),結(jié)果葡萄糖120g/L、玉米漿干粉15g/L、谷氨酸鈉20g/L得到了最高的生物量和DHA含量,分別為5.48 g/L·d和12.50%,為以后的發(fā)酵生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。
  聚酮合酶(PKS)是裂殖壺菌合成多不飽和脂肪酸的一個(gè)關(guān)鍵酶,本研究采用Genome walking方法,克隆得到了完整的pks1(4386bp)基因序列。并首次克隆得到了含有CAAT-box和TATA-box等啟動(dòng)子元件的pks1基因的啟動(dòng)子序列。為從分

5、子水平研究和改造裂殖壺菌來(lái)提高DHA的合成奠定了基礎(chǔ)。
  將本研究中獲得的pks1序列與實(shí)驗(yàn)室前期獲得的pks2序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)在2991bp-4386bp處序列相似性很高,達(dá)78%,該序列經(jīng)BLAST比對(duì)屬于丙二酰轉(zhuǎn)移酶酶域,具有將丙二酸單酰-CoA裝載到?;d體蛋白(ACP)的功能,該序列在兩段pks基因中都存在,推測(cè)其在DHA合成中具有重要作用,因此本研究將該序列構(gòu)建同源重組載體p18SCPGC-1,轉(zhuǎn)化裂殖壺菌,使其在

6、裂殖壺菌中過(guò)量表達(dá)。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、生物量及DHA含量的性狀分析,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化菌株生物量為5.02g/L·d,比未轉(zhuǎn)化菌株提高14.6%,轉(zhuǎn)化菌株的DHA含量是17.11%,比未轉(zhuǎn)化菌株提高37.90%。
  本文首次成功使用玉米漿干粉作為氮源來(lái)培養(yǎng)裂殖壺菌,為降低生產(chǎn)成本,提高裂殖壺菌的工業(yè)化生產(chǎn)水平提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù);對(duì)pks1基因的克隆分析及構(gòu)建酶域過(guò)表達(dá)菌株為研究DHA合成過(guò)程中相關(guān)酶的功能,并為基因工程

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