重組運動發(fā)酵單胞菌合成培養(yǎng)基的優(yōu)化及recG基因過表達菌株的構(gòu)建.pdf

1、運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonasmobilis）由于其高效的乙醇發(fā)酵性能和獨特的代謝途徑，其在乙醇發(fā)酵工業(yè)被認為具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前沒有適合重組運動發(fā)酵單胞菌生長和產(chǎn)醇的合成培養(yǎng)基，而且多數(shù)重組菌對于乙酸等纖維素水解液抑制因子的耐受性較低。本研究首先利用統(tǒng)計學(xué)方法優(yōu)化了重組運動發(fā)酵單胞菌的合成培養(yǎng)基，構(gòu)建了含有E.coli和Z.mobilis的recG基因的質(zhì)粒并在該菌和野生菌中進行表達，并用優(yōu)化的合成培養(yǎng)基進行了初步的發(fā)酵評價

2、。
　　通過一系列統(tǒng)計學(xué)實驗設(shè)計方法對木糖發(fā)酵Z.mobilis乙醇生產(chǎn)的合成培養(yǎng)基組分進行了優(yōu)化。首先利用Plackett-Burman實驗對19種培養(yǎng)基組分進行了篩選，確定影響乙醇生產(chǎn)的八種組分分別為木糖、(NH4)2SO4、檸檬酸鈉、琥珀酸、氯化膽堿、葉酸、維生素B6和硫胺素。隨后用最陡爬坡實驗確定五個成分（木糖、檸檬酸鈉、氯化膽堿、維生素B6和硫胺素）的最大相應(yīng)區(qū)域。之后用響應(yīng)面方法（RSM）對這五種組分進行優(yōu)化，建立了以

3、乙醇為目標(biāo)函數(shù)的數(shù)學(xué)模型。模型的方差分析（ANOVA）表明木糖和檸檬酸鈉對重組Z.mobilis的乙醇生產(chǎn)有顯著影響。且當(dāng)檸檬酸鈉濃度在0.1-1.6g/L范圍內(nèi)時，生物量和乙醇的生產(chǎn)與檸檬酸鈉濃度的對數(shù)值呈很好的線性關(guān)系。驗證實驗證實了模型的有效性，優(yōu)化的合成培養(yǎng)基中的乙醇產(chǎn)量為19.1g/L，比RM中（17.9g/L）提高了6.7％。對RSM優(yōu)化的合成培養(yǎng)基進行簡化，獲得的最終培養(yǎng)基S2組分為：木糖58.5g/L，檸檬酸鈉2.65g

4、/L，(NH4)2SO41g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO42g/L，泛酸鈣2.74mg/L。S2中的乙醇產(chǎn)量達到21.7g/L，比RM培養(yǎng)基中的乙醇產(chǎn)量（17.9g/L）提高20.7%。優(yōu)化的合成培養(yǎng)基適于重組菌的生長和產(chǎn)醇，且組份明確，能精確定量，適用于分析營養(yǎng)、代謝和生物測定等對定量有要求的研究。
　　為了獲得能夠在含有乙酸等抑制因子的纖維素水解液中高效產(chǎn)醇的重組Z.mobilis，我們構(gòu)建了攜帶Pgap啟動

5、子、rrnB終止子和E.coli或Z.mobilis的recG基因的質(zhì)粒pBBR1-MCS2-Pgap-ErecG-rrnB和pBBR1-MCS2-Pgap-ZmrecG-rrnB。通過電轉(zhuǎn)化獲得含有pBBR1-MCS2-Pgap-ErecG-rrnB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子CP4(ErecG)和CP4(X,ErecG)及含有pBBR1-MCS2-Pgap-ZmrecG-rrnB質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子CP4(ZmrecG)，并對其進行了初步的發(fā)酵評價。為后續(xù)的