裂殖壺菌人工海水配方優(yōu)化及pks3基因功能的研究.pdf

1、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)是ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3 PUFAs)，因具有抗病防癌、增強(qiáng)免疫、提高智力、保護(hù)視力等多種重要的生理功能而得到廣泛應(yīng)用。裂殖壺菌（Schizochytrium）是一種富含DHA的海洋真菌，因具有安全無(wú)害、易培養(yǎng)增殖、脂質(zhì)含量高、品質(zhì)優(yōu)良且成分單一等優(yōu)點(diǎn)而成為生產(chǎn)DHA的新生資源。目前，日本、美國(guó)及一些歐洲國(guó)家已經(jīng)將裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的工藝運(yùn)用到了工業(yè)化生產(chǎn)中，而國(guó)

2、內(nèi)仍處于發(fā)展階段，DHA產(chǎn)量不高成為亟待解決的問(wèn)題，因此，利用各種技術(shù)手段和生物學(xué)方法提高裂殖壺菌的DHA產(chǎn)量顯得尤為重要。本文從優(yōu)化培養(yǎng)基中的離子濃度以提高裂殖壺菌DHA產(chǎn)量，以及裂殖壺菌DHA合成相關(guān)基因的克隆和功能研究?jī)蓚€(gè)方面開(kāi)展了如下工作：
　　1、本研究在利用人工海水替代裂殖壺菌培養(yǎng)基中天然海水的基礎(chǔ)上，通過(guò)降低人工海水中的NaCl濃度，并探索性的在人工海水中加入 KH2PO4和FeSO4·7H2O來(lái)提高裂殖壺菌OUC0

3、07的生長(zhǎng)速度及DHA含量。結(jié)果表明，適量的減少人工海水中的NaCl以及添加 KH2PO4和FeSO4·7H2O能一定程度的提高裂殖壺菌OUC007的生長(zhǎng)速度和DHA含量，而濃度過(guò)高卻會(huì)產(chǎn)生抑制作用。三種鹽對(duì)裂殖壺菌生物量和DHA積累的最適濃度分別是：NaCl，200mmol/L；KH2PO4，10mmol/L；FeSO4·7H2O，2 mmol/L。進(jìn)一步對(duì)NaCl濃度，KH2PO4濃度和FeSO4·7H2O濃度進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)

4、驗(yàn)，獲得人工海水中鈉鹽、磷鹽、鐵鹽的最優(yōu)組合為：NaCl，200mmol/L；KH2PO4，15mmol/L；FeSO4·7H2O，3mmol/L。改良后的人工海水對(duì)裂殖壺菌OUC007生長(zhǎng)和DHA積累都起到了顯著的促進(jìn)作用。最優(yōu)組合實(shí)驗(yàn)組裂殖壺菌的生物量和DHA含量分別達(dá)到6.93g/l.d和19.66％，比使用天然海水的對(duì)照組生物量（4.68g/l.d）和DHA含量（12.78%）分別提高了48.08%和53.83%；比使用未改良人

5、工海水的對(duì)照組生物量（4.97g/l.d）和DHA含量（13.35%）分別提高了39.44%和47.27%。
　　2、本研究以GenBank中報(bào)道的pks3基因?yàn)閰⒖?，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并采用 Genome Walking的方法克隆得到了裂殖壺菌聚酮合酶（polyketide synthase）pks3基因，并對(duì)該基因進(jìn)行了氨基酸序列的分析和高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。結(jié)果表明裂殖壺菌聚酮合酶（polyketide synthase）的

6、pks3基因僅由一個(gè)外顯子組成，開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)為3693bp，編碼1230個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與GenBank中報(bào)道的pks3基因的氨基酸序列有81%的相似性,含有兩個(gè)保守的活性域，分別是3－酮酰－ACP還原酶酶域（KR酶域）和脫水/異構(gòu)酶酶域（DH酶域）。
　　本文分別以這兩個(gè)酶域?yàn)橥粗亟M位點(diǎn)，以 Zeocin抗性基因 Ble基因?yàn)榭剐院Y選標(biāo)記基因，構(gòu)建了基因敲除載體，希望通過(guò)基因敲除的方法來(lái)研究 pks3基因的功能。結(jié)果表

7、明，電轉(zhuǎn)化同源重組載體后，經(jīng)過(guò)傳代、篩選和鑒定得到了兩株穩(wěn)定遺傳的pks3基因缺失的裂殖壺菌，分別是KR酶域缺失的轉(zhuǎn)化菌株KR-和DH酶域缺失的轉(zhuǎn)化菌株DH-。這兩株轉(zhuǎn)化菌在菌落形態(tài)、菌體大小等方面都與出發(fā)菌株OUC168有很大差別，并且生產(chǎn)速度緩慢、生物量低、DHA積累量幾乎為0。據(jù)推測(cè)這種現(xiàn)象是由于裂殖壺菌pks3基因被缺失后，其DHA的合成代謝的終止不僅使得DHA不能積累，也使得細(xì)胞自身的代謝平衡被打破，直接影響了細(xì)胞的正常的生理