耐藥質(zhì)粒RP4在不同微生物聚集體中水平轉(zhuǎn)移規(guī)律及其對(duì)氨氧化的影響.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、細(xì)菌耐藥性擴(kuò)散以及耐藥基因的廣泛傳播嚴(yán)重威脅著人類健康。耐藥基因作為一類新型環(huán)境污染物,越來(lái)越引起研究者的廣泛關(guān)注。世界衛(wèi)生組織報(bào)告稱抗生素耐藥基因?qū)?huì)是本世紀(jì)威脅人類健康最重大的挑戰(zhàn)之一,甚至有報(bào)道預(yù)計(jì)2050年每年因耐藥菌感染死亡的人數(shù)將比現(xiàn)在癌癥患者還要多。污水生物處理系統(tǒng)作為水循環(huán)的重要環(huán)節(jié),其不僅是抗生素藥物進(jìn)入環(huán)境的一個(gè)重要途徑,同時(shí)也是耐藥細(xì)菌、耐藥基因富集,并在環(huán)境中播散的一個(gè)重要污染源,生物處理系統(tǒng)中耐藥基因水平轉(zhuǎn)移問(wèn)

2、題直接關(guān)系到環(huán)境生態(tài)安全。
  污水生物處理系統(tǒng)過(guò)程復(fù)雜,由于工藝運(yùn)行方式和反應(yīng)器的構(gòu)造不同,可以形成不同形態(tài)的微生物聚集體。課題構(gòu)建好氧顆粒污泥生物反應(yīng)系統(tǒng)(Granular Sludge Bioreactor,GSBR),以系統(tǒng)中不同形態(tài)微生物聚集體為研究對(duì)象,將粒徑(D)小于0.18mm定義為絮狀污泥,顆粒污泥分為三個(gè)粒徑范圍:小粒徑顆粒污泥(0.18mm<D<0.45mm),中等粒徑顆粒污泥(0.45mm<D<0.9mm)

3、與大粒徑顆粒污泥(D>0.9mm)。采用攜帶具有廣泛宿主RP4質(zhì)粒的E.coli K12(RP4)為供體菌,進(jìn)行一次性高濃度E.coli K12(RP4)投加,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)追蹤RP4質(zhì)粒在不同形態(tài)微生物聚集體中的分布變化,探討耐藥基因在不同微生物聚集體中水平轉(zhuǎn)移規(guī)律。結(jié)果顯示,第8d投加供體菌E.coli K12(RP4)后,GSBR中各粒徑污泥比例出現(xiàn)波動(dòng),第18d后重新達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。其中大粒徑顆粒污泥占總污泥比例70%

4、以上,是GSBR中主要微生物聚集體形態(tài)。投加供體菌后,因E.coli K12(RP4)被淘洗出GSBR,RP4質(zhì)粒不斷減少。RP4質(zhì)粒的豐度隨污泥粒徑增大而降低,其中豐度最高的為絮狀污泥,投加供體菌后絮狀污泥中RP4質(zhì)粒豐度達(dá)到8.10×10-2,4d后降低至4.14×10-6。豐度最低的為大粒徑顆粒污泥,投加供體菌后大粒徑顆粒污泥中RP4質(zhì)粒豐度為1.43×10-3,4d后降低至1.42×10-8。RP4質(zhì)粒在大粒徑、中等粒徑、小粒徑

5、顆粒污泥中存留時(shí)間分別為7d,14d和13d。第13d后RP4質(zhì)粒在絮狀污泥中的豐度穩(wěn)定維持在1.2×10-6-1.6×10-6之間,直至第26d后檢測(cè)為陰性。由此可得出以下結(jié)論:RP4質(zhì)粒在不同微生物聚集體中的水平轉(zhuǎn)移效率不同,污泥粒徑越大,RP4質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移效率越低。相比于絮狀污泥,好氧顆粒污泥系統(tǒng)能降低耐藥基因在污泥中的水平轉(zhuǎn)移,可有效控制耐藥基因傳播和擴(kuò)散的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。在無(wú)抗生素選擇壓力下,耐藥基因在絮狀污泥中存留時(shí)間長(zhǎng),依然會(huì)

6、對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響,表明耐藥基因的傳播范圍已經(jīng)超過(guò)了抗生素的污染范圍??刂颇退幓虻臄U(kuò)散,一方面需規(guī)范抗生素的使用,另一方面需要有效控制耐藥基因的轉(zhuǎn)移和傳播。
  硝化反應(yīng)在自然界的氮循環(huán)中起著重要作用,同時(shí)也是污水系統(tǒng)生物脫氮的關(guān)鍵反應(yīng),其包含了氨氧化細(xì)菌(Ammonia-oxidizing Bacteria, AOB)進(jìn)行的氨氧化作用和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(Nitrite-oxidizing Bacteria,NOB)進(jìn)行的亞硝酸

7、鹽氧化作用。AOB是硝化菌群的重要組成部分,氨氧化代謝反應(yīng)也是生物硝化過(guò)程中限速步驟和最為敏感的反應(yīng)之一。耐藥基因作為生物大分子,可直接參與細(xì)菌代謝,甚至影響、改變生物代謝過(guò)程,進(jìn)而直接影響污水生物處理系統(tǒng)的污染物去除效率。課題分別以GSBR和以自養(yǎng)硝化菌為主體的硝化污泥生物反應(yīng)系統(tǒng)(Nitrification Sludge Bioreactor,NSBR)為研究對(duì)象,采用供體菌E.coli K12(RP4)不同投加方法,觀察GSBR與

8、 NSBR系統(tǒng)中氨氮去除率的變化以及典型周期內(nèi)氨氮去除效果,利用培養(yǎng)計(jì)數(shù)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)供體菌和RP4質(zhì)粒進(jìn)行計(jì)數(shù)和定量追蹤,采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)對(duì)污泥中 AOB菌群結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行觀察,對(duì)DGGE圖譜中主要優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行切膠測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)和鑒定,采用MEGA軟件建立進(jìn)化樹進(jìn)行AOB菌群同源性分析。同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)AOB菌群豐度進(jìn)行分析,分別針對(duì)不同系統(tǒng)中

9、耐藥基因水平轉(zhuǎn)移對(duì)氨氮去除效率影響,氨氧化菌群變化以及代謝活性影響機(jī)制進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明,GSBR系統(tǒng)中一次性投加高濃度供體菌E.coli K12(RP4)對(duì)COD、氨氮的去除效果均有影響,但對(duì)氨氮去除的影響更加明顯。第8d投加E.coli K12(RP4)后,氨氮去除效果下降,第9d氨氮去除率最低為32.8%,隨后氨氮去除率恢復(fù)緩慢,直至第19d恢復(fù)至投加供體菌前水平。GSBR中大粒徑和中等粒徑顆粒污泥優(yōu)勢(shì)AOB菌群穩(wěn)定,絮狀污泥

10、和小粒徑顆粒污泥優(yōu)勢(shì)AOB發(fā)生了演變,但優(yōu)勢(shì)AOB為亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)以及與其同源性較高的菌群,因此認(rèn)為GSBR中AOB菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。投加E.coli K12(RP4)后,GSBR中各粒徑污泥AOB菌群豐度較為穩(wěn)定,反應(yīng)器運(yùn)行后期絮狀污泥和小粒徑顆粒污泥AOB出現(xiàn)增長(zhǎng)。RP4質(zhì)粒影響了AOB的代謝活性,隨著GSBR中RP4質(zhì)粒的減少,AOB代謝活性逐漸恢復(fù),新生AOB增長(zhǎng),GSBR氨氧化作用恢復(fù)。NSBR系統(tǒng)中,連

11、續(xù)投加低濃度與高濃度E.coli K12(RP4)時(shí),供體菌E.coli K12(RP4)并沒(méi)有因連續(xù)投加而在NSBR中定植與生長(zhǎng),并且數(shù)量不斷減少,RP4質(zhì)粒在總細(xì)菌中仍維持穩(wěn)定的比例,因此RP4質(zhì)粒發(fā)生了由異養(yǎng)供體菌向自養(yǎng)硝化菌的水平轉(zhuǎn)移。連續(xù)投加低濃度 E.coli K12(RP4)時(shí),氨氮降解速率減慢,氨氧化能力受到影響,而亞硝酸鹽氧化能力未受其影響。連續(xù)投加高濃度E.coli K12(RP4)時(shí),氨氮去除效果持續(xù)下降至50%-

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