多重耐藥RP4質(zhì)粒影響氨氧化菌硝化反應機制研究.pdf

1、抗生素耐藥問題嚴重威脅著人類的健康。水環(huán)境中的抗生素抗性基因（Antibiotic resistant genes，ARGs）種類和數(shù)量的增多，對環(huán)境和人類健康均造成了一定影響。目前ARGs已經(jīng)被定義為一種新的環(huán)境污染物。污水中同樣含有大量的ARGs，而污水生物處理系統(tǒng)不僅是抗生素進入環(huán)境的一個重要途徑，同時也是耐藥細菌、ARGs富集，并在環(huán)境中散播的一個重要污染源。污水處理過程中，生物脫氮有著重要的意義。這一過程先由氨氧化菌（Ammo

2、nia oxidizing bacteria，AOB）將氨氧化為亞硝酸鹽，再由亞硝酸鹽氧化菌（Nitrite oxidizing bacteria，NOB）將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽。ARGs作為生物大分子，有可能直接參與細菌的代謝進而影響污水生物處理系統(tǒng)的污染物去除效率。本研究在課題組前期針對RP4質(zhì)粒水平轉移影響膜生物反應器（Membrane bioreactor，MBR）和顆粒污泥生物反應器（Granular sludge biore

3、actor，GSBR）硝化效率的基礎上進一步深入探討RP4質(zhì)粒與AOB間水平轉移及其對AOB代謝影響的分子機制。
　　研究擬構建平行運行的，以硝化反應為主體的序批式反應器（Sequencing batch reactor，SBR），按照析因設計的實驗要求對不同反應器施加不同干預，觀察氨氮降解，亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮生成，總混合液懸浮固體（Mixed liquor suspended solids，MLSS）及出水SS（Suspend

4、ed solids）的變化情況，并通過分子生物學方法研究RP4質(zhì)粒對AOB的影響機制。
　　實驗共構建了4個SBR，其中水力停留時間（Hydraulic retention time，HRT）為7.2小時。經(jīng)過馴化調(diào)整后，SBR繼續(xù)平穩(wěn)運行約150天。正常運行過程中，氨氮在運行周期90 min內(nèi)基本去除完全，亞硝酸鹽氮在120 min時基本氧化完成，反應周期末硝酸鹽氮增加量等于初始的氨氮含量。四個SBR平均總MLSS約1235±5

5、5.146 mg/L，平均出水SS約為24.95±0.91 mg/mL，SV30約為24％。實驗同時分離純化了一株AOB，經(jīng)測序鑒定為Nitrosomonas europaea。
　　對4個SBR施加的干預為：A反應器投加不攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌；B反應器投加攜帶RP4質(zhì)粒的大腸桿菌；C反應器投加RP4質(zhì)粒；D反應器作為空白對照。干預前持續(xù)記錄7天數(shù)據(jù)；干預過程持續(xù)7天；干預結束后持續(xù)觀察14天，全程共計28天。觀察的指標有氨氮降解，

6、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮生成情況，總MLSS及出水SS的變化情況。實驗過程中同時提取污泥樣本，進行總DNA、總RNA的提取和RNA反轉錄的操作；并在SBR運行的第5個周期末對前一天投加供體菌進行計數(shù)。研究結果表明，僅投加攜帶RP4質(zhì)粒的供體菌的B反應器出現(xiàn)了具有統(tǒng)計學意義的變化（P<0.05）。且該反應器投加供體菌后氨氮去除率即明顯降低（P<0.05），停止投菌后未恢復。在實驗第21天，氨氮去除率降低至70%，然后開始恢復，第25天上升至9

7、9%以上。由此可知RP4質(zhì)粒的存在降低了反應器的氨氧化效率，且影響可持續(xù)一定時間。
　　針對B反應器，亞硝酸鹽氮的生成速率在第20天出現(xiàn)了降低，峰值濃度由約3.0mg/L降低至約1.7mg/L。同時硝酸鹽氮生成減少，第20天時硝酸鹽氮終濃度由約42mg/L降低至40mg/L，但單位時間內(nèi)生成速率并無明顯變化?？梢奟P4質(zhì)粒的存在未影響反應器的亞硝酸鹽氧化效率，亞硝酸鹽氮并未出現(xiàn)累積?，F(xiàn)已知的亞硝酸鹽氮清除時間延長和周期末硝酸鹽氮濃

8、度降低更有可能是由于氨氧化受抑制而導致的。B反應器的出水SS出現(xiàn)了上升的趨勢（P<0.05），且出水SS最高值約達35mg/L。至第14天停止投菌后出水SS仍未恢復。直至后期第21天左右時，出水SS逐漸恢復。此后的出水SS平均水平降低至25mg/L水平。總MLSS至第28天實驗結束后降低至約800 mg/L（P<0.05）。
　　研究發(fā)現(xiàn)投加攜帶RP4質(zhì)粒的供體菌對 SBR造成影響是由于RP4質(zhì)粒與AOB接合轉移造成的，單純的供體

9、菌和游離的RP4質(zhì)粒并不能產(chǎn)生較大影響。
　　研究進一步通過所獲得的DNA，cDNA，結合供體菌數(shù)量變化，研究RP4質(zhì)粒對AOB的影響，并對其機制進行分析。
　　變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）結合條帶測序顯示反應器運行初始階段AOB主要為Nitrosomonas和βproteobacterium菌屬，均為不可培養(yǎng)細菌。整個實驗階段主要優(yōu)勢菌群并未發(fā)

10、生明顯變化；H指數(shù)在投菌前后也未發(fā)生明顯改變（P>0.05）。說明RP4質(zhì)粒造成的氨氧化效率降低不是由于菌群結構改變造成的。
　　持續(xù)投加供體菌時，供體菌數(shù)量穩(wěn)定在105 cfu/mL。停止投菌后供體菌數(shù)量進行性下降，截止第28天，出水中仍能檢測到102 cfu/mL的供體菌。熒光定量PCR測定AOB，RP4質(zhì)粒和總細菌的數(shù)量變化。結果顯示，在投加供體菌之前，AOB與總細菌的比值約為10-4。投加供體菌的過程中，AOB與細菌的比值

11、依舊保持穩(wěn)定。投加供體菌結束后，從第20天開始，AOB與總細菌的比值出現(xiàn)了一定升高（P<0.05）。在投加供體菌之前，RP4質(zhì)粒與總細菌的比值約為10-7。投加供體菌之后，比值迅速升高，達到10-2，并在投菌過程中基本維持在這一水平。投加供體菌結束之后，RP4與總細菌的比值出現(xiàn)一定的下降，但程度并不明顯，至第28天時比值仍大于10-5，提示了RP4質(zhì)粒與AOB等反應器內(nèi)原有的微生物之間發(fā)生了接合轉移。
　　通過AOB探針、RP4探

12、針和總細菌核酸染料DAPI進行的熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）提示了氨氧化菌和RP4質(zhì)粒的共定位關系，即質(zhì)粒位于氨氧化菌細胞內(nèi)。說明了RP4質(zhì)粒在活性污泥中發(fā)生了水平轉移。同時純培養(yǎng)AOB，不攜帶RP4質(zhì)粒的大腸桿菌和未投加供體菌的活性污泥的三個對照組中并沒發(fā)現(xiàn)熒光共定位的現(xiàn)象。這表明RP4質(zhì)粒與包括AOB在內(nèi)的污泥中微生物的接合轉移，即異養(yǎng)菌（供體菌）向自養(yǎng)菌（受體菌）的

13、接合轉移，是可以在SBR正常運行過程中實現(xiàn)的。
　　由cDNA通過熒光定量PCR得到的amoA基因和hao基因表達情況的數(shù)據(jù)繪制成熱圖（heatmap），發(fā)現(xiàn)僅投加攜帶RP4質(zhì)粒的供體菌的B反應器中AOB的amoA基因和hao基因的轉錄有所增加。停止投菌（第14天）后，轉錄依然處于較高水平。至第28天時，amoA基因和 hao基因的轉錄未明顯下調(diào)。RP4質(zhì)粒在AOB中發(fā)生接合轉移進而上調(diào)amoA基因和hao基因的轉錄，這有可能是A

14、MO等相關酶數(shù)量或（和）功能不足導致的反饋調(diào)節(jié)。
　　綜合以上結果：
　?。?）構建了平行運行硝化反應器系統(tǒng)（SBR），并分離純化出一株AOB，經(jīng)鑒定為Nitrosomonas europaea。
　　（2）研究證實了在SBR系統(tǒng)中，RP4質(zhì)粒的水平轉移可通過供體菌（異養(yǎng)菌）與包括AOB（自養(yǎng)菌）在內(nèi)的活性污泥微生物發(fā)生接合轉移而實現(xiàn)。
　?。?）攜帶RP4質(zhì)粒的供體菌與AOB的接合轉移，是造成SBR硝化效率下降

15、，污泥形狀改變（增加出水SS）的主要原因。單純的供體菌和RP4質(zhì)粒并不能產(chǎn)生較大影響。
　?。?）構建的SBR中AOB的優(yōu)勢菌群是Nitrosomonas和βproteobacterium。在發(fā)生RP4質(zhì)粒的接合轉移之后，菌群結構并未發(fā)生明顯改變。說明RP4質(zhì)粒造成的氨氧化效率降低不是由于菌群結構改變造成的。
　?。?）RP4質(zhì)粒在AOB中發(fā)生的接合轉移可以上調(diào)amoA基因和hao基因的轉錄。這有可能是RP4質(zhì)粒導致的AMO