中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)激活單核細(xì)胞在ANCA相關(guān)性血管炎的作用.pdf

1、目的：
　　抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)相關(guān)血管炎(ANCA associated vasculitis，AAV)屬于自身免疫系統(tǒng)性小血管炎，病變常累及腎臟，主要表現(xiàn)為寡免疫復(fù)合物局灶節(jié)段壞死性腎小球腎炎(pauci-immune focal segmental necrotizing glomerulonephritis，PiFSGN)，可伴新月體

2、形成。在現(xiàn)有免疫抑制劑治療基礎(chǔ)上病情反復(fù)進(jìn)展，最終發(fā)展至終末期腎衰竭。研究者發(fā)現(xiàn)針對B淋巴細(xì)胞的藥物治療仍有很高復(fù)發(fā)率，尤其PR3-ANCA(+)患者高達(dá)50％，說明其發(fā)病機(jī)制并沒完全弄清楚。因此，需更加深入地研究AAV的發(fā)病機(jī)理，以尋找更有效的治療方案。
　　單核細(xì)胞(Monocyte，Mo)來源于骨髓造血干細(xì)胞，浸潤于組織后可分化為巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，它參與病原微生物及內(nèi)源性物質(zhì)的吞噬、抗原提呈、T淋巴細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等重要過程

3、，單核巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大吞噬功能，吞噬異常物質(zhì)后可分泌促炎因子或抑炎因子，在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)扮演重要作用。研究表明單核細(xì)胞異常激活分泌大量炎癥介質(zhì)參與多種疾病病理生理過程，包括AAV。在AAV節(jié)段壞死性腎小球腎炎早期階段以單核細(xì)胞浸潤為主，表明單核細(xì)胞異常激活可能在AAV腎損害扮演了啟動(dòng)作用。
　　ANCA相關(guān)性血管炎最顯著血清學(xué)特征是患者血清可檢測出抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體，它可激活中性粒細(xì)胞脫顆粒及產(chǎn)生活性氧，釋放中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(

4、neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs的形成釋放了胞漿自身抗原DNA、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、蛋白水解酶3(Protease3，PR3)及抗微生物肽LL37(Cathelicidin LL37，LL37)等物質(zhì)，這些自身抗原暴露于免疫監(jiān)視中誘導(dǎo)自身抗體形成及自身免疫性疾病。研究表明：異常形成的NETs參與多種自身免疫性疾病，包括誘發(fā)ANCA相關(guān)性血管炎。異常分泌

5、的炎癥介質(zhì)一直被證實(shí)參與AAV病理損傷，如白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、干擾素α（interferon-α，IFN-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）等。但NETs對外周血單核細(xì)胞激活分泌炎癥介質(zhì)的影響以及意義尚不完全清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)擬觀察NETs對單核細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)IL-1β、IFN-α、TNF-α、IL-6、MCP-1、白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL

6、-10)、白細(xì)胞介素12(interleukin-12，IL-12)的影響，探討NETs對單核細(xì)胞活化的影響。
　　方法：
　　1、分別抽取6名健康志愿者（研究生同學(xué)）外周血各55ml，共后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、每人取5ml外周血，采用Polymorphprep分離液密度梯度離心法分離中性粒細(xì)胞，DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)，Beckman流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞提取純度。純化的中性粒細(xì)胞調(diào)整密度一致后分為對照組和PMA組兩

7、組，對照組采用等量PBS與中性粒細(xì)胞孵育，PMA組采用等量佛波脂（PMA，終濃度30ng/ml）與中性粒細(xì)胞孵育4h誘導(dǎo)NETs形成，吸棄含PMA的培養(yǎng)上清并洗棄殘留PMA后留存于培養(yǎng)板底的即為NETs，DAPI熒光染色，Leica激光共聚焦顯微鏡觀察NETs形成效率。
　　3、每人取50ml外周血，采用Ficoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠法（StemCells人CD14正選試劑盒）從外周血單個(gè)核細(xì)胞分離提取單核細(xì)胞

8、，Beckman流式細(xì)胞儀檢測單核細(xì)胞提取純度。純化的單核細(xì)胞調(diào)整密度一致后分為對照組及NETs組，對照組采用等量細(xì)胞培養(yǎng)基與單核細(xì)胞培養(yǎng)體系，NETs組為等量上訴實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的培養(yǎng)板底部NETs與單核細(xì)胞共培養(yǎng)體系，孵育12小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清存于-80℃冰箱。LEGENDplex人炎癥因子試劑盒檢測各組培養(yǎng)上清IL-1β、IFN-α、TNF-α、IL-6、MCP-1、IL-10、IL-12的濃度。
　　4、數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)

9、準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、Polymorphprep分離液密度梯度離心法分離提取健康志愿者外周血中性粒細(xì)胞，DAPI染色，細(xì)胞核呈分葉核，流式細(xì)胞儀鑒定純度為98％。純化的中性粒細(xì)胞分為對照組和PMA組兩組，孵育4小時(shí)后，DAPI染色行激光共聚焦顯微鏡觀察，對照組中性粒細(xì)胞核仍保持分葉核結(jié)構(gòu)，而PMA組分

10、葉核結(jié)構(gòu)破壞，可見絲狀DNA即NETs形成。
　　2、CD14正選試劑盒提取單核細(xì)胞純度為95.3％。
　　3、NETs對單核細(xì)胞分泌IL-1β的影響：NETs組與對照組IL-1β濃度分別為（97.60±60.11）pg/mL、＜1.17pg/mL，與對照組相比，NETs組單核細(xì)胞分泌IL-1β水平顯著升高(P＜0.05)。
　　4、NETs對單核細(xì)胞分泌IFN-α的影響：NETs組與對照組IFN-α濃度分別為（208

11、.90±77.38）pg/mL、＜1.17pg/mL，與對照組相比，NETs組單核細(xì)胞分泌IFN-α水平顯著升高(P＜0.01)。
　　5、NETs對單核細(xì)胞分泌TNF-α的影響：NETs組與對照組TNF-α濃度分別為（218.88±86.27）pg/mL、＜0.17pg/mL，與對照組相比，NETs組單核細(xì)胞分泌TNF-α的水平顯著升高(P＜0.01)。
　　6、NETs對單核細(xì)胞分泌MCP-1的影響：NETs組與對照組M

12、CP-1濃度分別為（1063.25±740.01）pg/mL、（157.16±3.86）pg/mL，與對照組相比，NETs組單核細(xì)胞分泌MCP-1水平顯著升高(P＜0.05)。
　　7、NETs對單核細(xì)胞分泌IL-6的影響：NETs組與對照組IL-6濃度分別為（67.76±15.51）pg/mL、（2.76±0.47）pg/mL，與對照組相比，NETs組單核細(xì)胞分泌IL-6的水平顯著升高(P＜0.01)。
　　8、NETs對

13、單核細(xì)胞分泌IL-10的影響：NETs組與對照組IL-10濃度分別為1.68±0.58pg/mL、＜1.15pg/mL，兩組IL-10水平無顯著差異。
　　9、NETs對單核細(xì)胞分泌IL-12的影響：NETs組與對照組IL-12濃度分別為＜1.30pg/mL、＜1.30pg/mL，兩組IL-12水平無顯著差異。
　　結(jié)論：
　　NETs能激活單核細(xì)胞，誘導(dǎo)IFN-α、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1炎癥介質(zhì)