口腔扁平苔蘚與NF-κB相關細胞因子和幽門螺桿菌關系的研究及藥物對牙齦成纖維細胞增殖作用的影響.pdf

1、第一部分：口腔扁平苔蘚與NF‐κB相關細胞因子和幽門螺桿菌關系的研究
　　目的：口腔扁平苔蘚(Oral lichen planus OLP)是一種與自身免疫相關常見口腔疾病，目前為止OLP病因機制尚未完全明確。近年來核轉錄因子-κB(nuclearfactor-KB NF-κB)引導的炎癥通路及其介導的炎癥介質的紊亂一直成為研究的熱點。NF-κB可能通過引起細胞因子網絡紊亂，進一步介導炎癥反應參與口腔扁平苔蘚疾病的發(fā)生。
　

2、　楊鳳英等采用基因芯片技術篩選出與OLP關系最密切的是幽門螺桿菌感染上皮細胞信號傳導通路 ECS-HP（Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection）[1]，口腔中幽門螺桿菌（Helicobacter pylori HP）感染與口腔扁平苔蘚疾病的發(fā)生存在密切關系，HP也與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、胃癌的發(fā)病密切相關。HP感染胃壁粘膜后可以激活N

3、F-κB通路并介導炎癥反應?？谇徽衬づc胃壁粘膜均來自于外胚層，口腔黏膜感染HP后引起的炎癥機制可能與胃壁粘膜一致?？谇恢蠬P感染激活NF-κB炎癥通路在OLP發(fā)病中的作用有待進一步研究。
　　本研究采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA），檢測口腔扁平苔蘚患者與健康者血清、唾液中IL-8、RANTES的蛋白水平變化，通過觀察血清和唾液中IL-8、RANTES等炎癥因子的變化水平以及感染幽門螺桿菌OLP患者血清和唾液中細胞因子變化水平，初

4、步探討NF-κB炎癥通路在口腔扁平苔蘚發(fā)病中的作用機制以及OLP與HP的關系。
　　方法：
　　1.采用ELISA方法對口腔扁平苔蘚患者和健康者血清、唾液中IL-8、RANTES的含量進行測定，分析IL-8、RANTES在血清、唾液中表達。
　　病例納入標準：口腔扁平苔蘚患者30例（糜爛型14例，普通型16例）和健康志愿者30例，分別收集口腔扁平苔蘚患者和健康志愿者的唾液、血清樣本。
　　2.采用ELISA方法檢

5、測HP感染陽性及HP陰性的口腔扁平苔蘚患者血清、唾液中IL-8、RANTES的表達，分析HP感染與 NF-κB通路在口腔扁平苔蘚發(fā)病中的關系及其關鍵因子的表達。
　　3.幽門螺桿菌感染檢測：快速尿素酶試驗法檢測口腔扁平苔蘚患者牙菌斑中的幽門螺桿菌，探討OLP患者和HP感染的相關性。
　　結果：
　　1.口腔扁平苔蘚患者與對照組相比血清和唾液中IL-8、RANTES顯著增高，P<0.05，差別有統(tǒng)計學意義；
　　2

6、.口腔扁平苔蘚血清中糜爛型與普通型IL-8、RANTES細胞因子表達水平差別無統(tǒng)計學意義，P>0.05，口腔扁平苔蘚唾液中糜爛型IL-8含量較普通型扁平苔蘚顯著升高，P<0.05；
　　3.將口腔扁平苔蘚分為HP感染陽性和HP感染陰性，血清中HP感染陽性較HP感染陰性者IL-8、RANTES表達水平顯著增高，P<0.05。唾液中HP感染陽性較HP感染陰性者IL-8、RANTES表達水平差別無統(tǒng)計學意義，P>0.05。
　　結

7、論：
　　1.口腔扁平苔蘚患者血清和唾液中IL-8、RANTES細胞因子水平與對照組相比均有不同程度的升高，提示口腔扁平苔蘚的發(fā)病可能與NF‐κB通路介導的炎癥反應相關，阻斷NF‐κB炎癥通路的激活可能成為治療口腔扁平苔蘚新的靶點，為口腔扁平苔蘚的治療提供新思路與方法。
　　2.血清中HP感染陽性較HP感染陰性者IL-8、RANTES表達水平顯著增高，提示口腔扁平苔蘚的發(fā)病可能與口腔中HP感染有一定相關性，并進一步介導免疫炎

8、癥反應。
　　第二部分：藥物對牙齦成纖維細胞增殖作用的影響
　　目的：目前藥物性牙齦增生的機制尚未完全明確。一些研究表明牙齦炎、牙周炎菌斑的刺激可能有助于牙齦增生發(fā)展。本課題利用健康人牙齦組織原代培養(yǎng)牙齦成纖維細胞，分別應用硝苯地平、IL-1以及兩種藥物共同干預牙齦成纖維細胞，觀察不同藥物對牙齦成纖維細胞的增殖活性的影響，進一步探討藥物性牙齦增生機制以及藥物性牙齦增生與牙齦炎的關系，為臨床上藥物性牙齦增生治療提供新的思路。<

9、br>　　方法：
　　1.牙齦成纖維細胞原代培養(yǎng)：按照原代細胞組織塊培養(yǎng)方法，將牙齦組織塊接種于25mL細胞培養(yǎng)瓶中，觀察原代細胞游出狀態(tài)。細胞爬滿瓶底約80％時進行傳代。使用0.25％胰酶消化傳代培養(yǎng)，首次傳代按1:1的比例，再次傳代以1:3的比例進行。取第5代牙齦成纖維細胞用于實驗。其余細胞凍存?zhèn)溆谩?br>　　2.牙齦成纖維細胞鑒定：倒置顯微鏡下觀察原代細胞形態(tài)學變化；光鏡下觀察原代細胞HE染色及免疫組化結果（抗波形蛋白、抗

10、角蛋白）。
　　3.細胞增殖實驗：采用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyltetrazolium， MTT)法測定不同條件培養(yǎng)液下細胞數(shù)量變化（A組為空白對照組，不加任何藥物；B組為硝苯地平組，又分為3個濃度亞組，B1組加入硝苯地平1200μg/L，B2組加入硝苯地平360μg/L，B3組加入硝苯地平108μg/L；C組為IL-1組，加入IL-1β10ng/ml；D組為硝苯地平+IL-1組，分為3個亞組，D1組=B1組

11、+C組，D2組=B2組+C組，D3組=B3組+C組），在酶聯(lián)免疫儀上測定490 nm處各孔吸光度值(OD值)。本實驗重復3次。利用SPSS21.0軟件分析數(shù)據。
　　結果：
　　1.原代培養(yǎng)細胞從組織塊游離出的時間約為10天，倒置顯微鏡鏡下觀察可見散在的貼壁伸展細胞，細胞形態(tài)呈長梭形，第11天組織塊周圍細胞明顯增多，組織塊周圍形成細胞生長暈形態(tài)。原代第12天，可見細胞呈長梭形，胞核圓形或卵圓形，細胞數(shù)量明顯增多。約12-14

12、天細胞逐漸融合；
　　2.牙齦成纖維細胞鑒定：經傳代培養(yǎng)后牙齦成纖維細胞形態(tài)逐漸向典型的成纖維樣細胞轉化，細胞生長呈漩禍狀或放射走行，有極性且排列緊密，突起變短，呈長梭形、紡綞形、不規(guī)則三角形態(tài)(見Fig.1)。HE染色示細胞呈梭形或不規(guī)則三角形態(tài)，核圓或卵圓，胞核內可見分裂象，胞漿粉紅，胞核藍染(見Fig.2)。光鏡下觀察細胞免疫組織化學染色，波形蛋白表達為強陽性，呈棕黃著色，定位于細胞的胞質中，陽性顆粒在胞質內分布均勻，細胞核

13、內染色陰性，細胞外未見陽性表達，細胞核經蘇木精復染為藍色，說明細胞來源于外胚間充質(見Fig.3)，對照組細胞染色陰性。角蛋白表達為陰性(見Fig.4)；
　　3.細胞增殖實驗：不同濃度培養(yǎng)液作用后細胞增殖結果：培養(yǎng)0h、24h、48h、72h、96h各組OD值變化見Table1。
　　結論：
　　1.原代培養(yǎng)的細胞抗波形蛋白表達陽性、抗角蛋白表達陰性以及形態(tài)學上觀察結果符合牙齦成纖維細胞，保留此細胞株，以便用于今后實