蛋氨酸對(duì)噪聲導(dǎo)致聽覺損傷預(yù)防和治療作用的研究.pdf

1、目的：
　　研究蛋氨酸對(duì)噪聲性耳聾小鼠聽力損失的預(yù)防與治療作用。通過動(dòng)物模型來(lái)研究抗氧化劑蛋氨酸對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象耳蝸組織在功能學(xué)、形態(tài)學(xué)、氧化應(yīng)激水平和凋亡水平以及連接蛋白26（Cx26）和連接蛋白30（Cx30）方面是否具有預(yù)防和治療效果，并為研究噪聲性耳聾的發(fā)病機(jī)制提供進(jìn)一步依據(jù)。
　　方法：
　　1建立噪聲性耳聾動(dòng)物模型：選取健康40只雌性昆明小鼠，根據(jù)隨機(jī)分組原則分為①空白對(duì)照組（n=10）②噪聲組（n=10）③噪聲

2、前給予蛋氨酸組（n=10）④噪聲后給予蛋氨酸組（n=10）。首先進(jìn)行昆明小鼠外耳、中耳及內(nèi)耳的檢查，以排除影響內(nèi)耳聽力功能的因素。①空白對(duì)照組：不給予噪聲處理，正常環(huán)境下生活，腹腔注射生理鹽水400mg/Kg，2次/天，連續(xù)3天；②噪聲組：噪聲前3天給予生理鹽水400mg/Kg腹腔注射，2次/天，連續(xù)3天，再給予100dB SPL白噪聲，連續(xù)3天,每天持續(xù)8小時(shí)；③噪聲前給予蛋氨酸組：噪聲前3天給予蛋氨酸溶液400mg/Kg腹腔注射，連

3、續(xù)3天，2次/天，再給予100dB SPL白噪聲，連續(xù)3天，每天持續(xù)8小時(shí)；④噪聲后給予蛋氨酸組：給予100dB SPL白噪聲，連續(xù)3天，每天持續(xù)8小時(shí)，噪聲3天結(jié)束后給予蛋氨酸溶液400mg/Kg腹腔注射，連續(xù)3天，2次/天。
　　2監(jiān)測(cè)噪聲暴露前后小鼠聽力功能變化：四組昆明小鼠在噪聲暴露前、噪聲暴露后即刻和噪聲暴露后第4天，分別都接受聽性腦干反應(yīng)（ABR）來(lái)評(píng)估聽力功能。
　　3顯微水平下耳蝸結(jié)構(gòu)改變：通過耳蝸基底膜鋪片

4、HE染色并在普通光學(xué)顯微鏡下觀察毛細(xì)胞損傷情況，再通過耳蝸基底膜鋪片Myosin-Ⅵ染色在激光共聚焦顯微鏡下觀察基底膜毛細(xì)胞損傷情況。
　　4免疫組織化學(xué)方法：通過免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)氧化應(yīng)激產(chǎn)物4-羥基壬烯醛（4-HNE），以評(píng)價(jià)各組氧化應(yīng)激水平。
　　5 TUNEL凋亡檢測(cè)：通過TUNEL凋亡方法，觀察細(xì)胞凋亡情況。
　　6 Western blot法：使用Western blot法檢測(cè)Cx26和Cx30兩種縫隙

5、鏈接蛋白在各組中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1一般觀察結(jié)果：空白對(duì)照組小鼠正常生長(zhǎng)，各項(xiàng)反應(yīng)均好，耳廓對(duì)聲音反應(yīng)正常；噪聲組小鼠不好動(dòng)，耳廓對(duì)聲音反應(yīng)較遲鈍；噪聲前給予蛋氨酸組的小鼠正常生長(zhǎng)，耳廓對(duì)聲音反應(yīng)較對(duì)照組差；噪聲后給予蛋氨酸組的小鼠正常生長(zhǎng)，耳廓對(duì)聲音反應(yīng)較對(duì)照組差。
　　2聽覺腦干反應(yīng)（ABR）測(cè)試結(jié)果：實(shí)驗(yàn)前各組動(dòng)物ABR閾值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），空白對(duì)照組小鼠ABR閾值為（16.25±3.5

6、8）dB SPL，噪聲組小鼠ABR閾值為（16.00±3.37）dB SPL，噪聲前給予蛋氨酸組的小鼠ABR閾值為（16.00±2.69）dB SPL，噪聲后給予蛋氨酸組的小鼠ABR閾值為（15.75±2.90）dB SPL；噪聲暴露后即刻：空白對(duì)照組小鼠ABR閾值為（16.75±3.74）dB SPL，噪聲組小鼠ABR閾值為（58.75±6.80）dB SPL，噪聲前給予蛋氨酸組的小鼠ABR閾值為（52.75±9.01） dB SPL

7、，噪聲后給予蛋氨酸組的小鼠ABR閾值為（60.00±5.14）dB SPL，除空白對(duì)照組外，其余接受噪聲處理的三組小鼠噪聲暴露前后自身配對(duì)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；噪聲暴露后第4天，空白對(duì)照組小鼠ABR閾值為（16.50±3.16）dB SPL，噪聲組小鼠ABR閾值為（36.25±7.48） dB SPL，噪聲前給予蛋氨酸組的小鼠ABR閾值為（23.00±3.29）dB SPL，噪聲后給予蛋氨酸組的小鼠ABR閾值為（23.25

8、±3.13）dB SPL，除空白對(duì)照組外，其余三組小鼠兩兩比較，噪聲組與噪聲前、后給予蛋氨酸組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而噪聲前給予蛋氨酸組與噪聲后給予蛋氨酸組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3基底膜鋪片HE染色和Myosin-Ⅵ染色結(jié)果：空白對(duì)照組耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞分布整齊，細(xì)胞輪廓清晰，未發(fā)現(xiàn)變性等病理改變。噪聲組與空白對(duì)照組相比，耳蝸基底膜毛細(xì)胞出現(xiàn)較為明顯的缺失，底轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞尤為明顯。噪聲前給予蛋氨酸

9、組與空白對(duì)照組相比，耳蝸基底膜毛細(xì)胞出現(xiàn)散在的缺失，可見變性等病理改變。噪聲后給予蛋氨酸組與空白對(duì)照組相比，耳蝸基底膜毛細(xì)胞同樣出現(xiàn)了散在的缺失，主要出現(xiàn)在外毛細(xì)胞，內(nèi)毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整。
　　44-HNE免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：空白對(duì)照組小鼠耳蝸組織切片中，在基底膜、血管紋和螺旋側(cè)韌帶中沒有發(fā)現(xiàn)4-HNE的表達(dá)；噪聲組耳蝸基底膜、血管紋和螺旋側(cè)韌帶中4-HNE表達(dá)較明顯；噪聲前給予蛋氨酸組和噪聲后給予蛋氨酸組中，發(fā)現(xiàn)基底膜、血管紋

10、和螺旋側(cè)韌帶中有4-HNE的表達(dá)，但均弱于噪聲組。
　　5 TUNEL凋亡檢測(cè)結(jié)果：空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳蝸組織切片TUNEL染色中耳蝸基底膜、血管紋和螺旋側(cè)韌帶中沒有發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞；而在噪聲組上述三個(gè)結(jié)構(gòu)中均發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，并且表達(dá)明顯；噪聲前給予蛋氨酸組和噪聲后給予蛋氨酸組均出現(xiàn)了凋亡細(xì)胞，但凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于噪聲組。
　　6 Cx26和Cx30 Western blot檢測(cè)結(jié)果：噪聲組中Cx26和Cx30的表達(dá)明顯弱于空白

11、對(duì)照組、噪聲前給予蛋氨酸組和噪聲后給予蛋氨酸組，而空白對(duì)照組中Cx26和Cx30的表達(dá)強(qiáng)于噪聲前給予蛋氨酸組和噪聲后給予蛋氨酸組，但噪聲前給予蛋氨酸組和噪聲后給予蛋氨酸組中Cx26和Cx30的表達(dá)沒有明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1噪聲性耳聾主要損傷耳蝸Corti器的內(nèi)、外毛細(xì)胞，并且以底轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞損傷為主，蛋氨酸對(duì)噪聲性耳聾造成的聽力下降和形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞起到一定的保護(hù)作用。
　　2噪聲通過活性氧和細(xì)胞凋亡導(dǎo)致噪聲性耳聾的