靶向藥物sorafenib抑制肝癌乏氧應(yīng)答機(jī)制及光學(xué)分子成像監(jiān)測評價其早期療效的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、中晚期肝癌的主要治療手段是經(jīng)肝動脈化療栓塞（TACE）。TACE通過栓塞供血動脈造成腫瘤缺血缺氧，產(chǎn)生壞死。但TACE造成的腫瘤微環(huán)境乏氧（hypoxia）可誘導(dǎo)殘存的癌細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力提高。如何降低TACE后肝癌細(xì)胞的乏氧應(yīng)答成為提高TACE遠(yuǎn)期療效的關(guān)鍵。
　　Sorafenib是一種多激酶抑制劑，具有多個治療靶點(diǎn)，已被證實(shí)可以顯著延長肝癌患者的生存時間。將sorafenib與TACE結(jié)合能否進(jìn)一步

2、提高患者的預(yù)后是目前臨床研究的熱點(diǎn)。有研究顯示二者聯(lián)合會產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，但具體機(jī)制不明，sorafenib是否通過抑制肝癌的乏氧應(yīng)答來提高TACE的療效尚不十分清楚。此外，sorafenib雖然可以延長肝癌患者的生存時間，但在治療的反應(yīng)率方面卻并不突出，部分獲益患者的腫瘤甚至一直在增長。如何準(zhǔn)確的反映和評價sorafenib的療效，需要我們尋找新的評價手段和方法。Sorafenib作為一種靶向治療藥物，價格昂貴，如能早期判定其對某個特定患

3、者是否起效以及何種劑量下起效，臨床上可以指導(dǎo)無效患者盡早停藥及更換藥物，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；對于因服藥副反應(yīng)嚴(yán)重而需要減量的患者，可以監(jiān)測并指導(dǎo)合理的用藥劑量。針對上述問題，本研究課題擬從以下三個方面進(jìn)行系統(tǒng)性研究。
　　一、Sorafenib對肝癌細(xì)胞乏氧應(yīng)答的干預(yù)作用研究
　　材料和方法：
　　人肝癌SMMC-7721細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至70%融合后，分成如下三組：①正常條件培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞；②乏氧培養(yǎng)24h

4、的SMMC-7721細(xì)胞；③加入 sorafenib（4μmol/L）預(yù)處理的SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行乏氧培養(yǎng)24h。采用CCK-8檢測各組細(xì)胞的增殖活性；流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布；細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞粘附性變化；Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞侵襲性變化。
　　結(jié)果：
　?。?）細(xì)胞增殖活性顯示：乏氧培養(yǎng)組（150μM CoCl2,24h）與對照組相比細(xì)胞增殖能力略有增加，但差異不顯著（P>0.05）

5、，sorafenib（4μmol/L1h）預(yù)處理后再乏氧培養(yǎng)組與對照組及乏氧培養(yǎng)組相比，細(xì)胞增殖能力降低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。（2）細(xì)胞周期檢測顯示：乏氧培養(yǎng)組（150μM CoCl2,24h）與對照組相比S期細(xì)胞比例降低，G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例增加；sorafenib處理組與對照組相比，S期細(xì)胞也有所降低，但差異均不顯著（P>0.05），而G0/G1期細(xì)胞顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），G2

6、/M期細(xì)胞幾乎無改變；sorafenib處理組與乏氧培養(yǎng)組比較，S期細(xì)胞比例有所升高，接近對照組水平，而G2/M期細(xì)胞則明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與對照組接近。（3）細(xì)胞粘附能力顯示：乏氧培養(yǎng)組的細(xì)胞粘附能力與對照組相比略有增加，經(jīng)sorafenib處理后，細(xì)胞粘附力顯著降低，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。（4）Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：乏氧培養(yǎng)組（150μM CoCl2,24h）與對照組相比細(xì)胞侵

7、襲力降低（P<0.05）；sorafenib預(yù)處理組與對照組及乏氧組相比，細(xì)胞侵襲力均有非常明顯降低，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　?。?）乏氧可誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞產(chǎn)生乏氧應(yīng)答，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞增殖及粘附能力增強(qiáng)，細(xì)胞周期G0/G1期和G2/M期阻滯。（2）SMMC-7721肝癌細(xì)胞在sorafenib預(yù)處理后再進(jìn)行乏氧培養(yǎng)，其乏氧應(yīng)答反應(yīng)被明顯抑制，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞增殖及粘附能力降低，細(xì)

8、胞周期阻滯部分逆轉(zhuǎn)，侵襲能力進(jìn)一步降低等，證實(shí)sorafenib在抑制人肝癌細(xì)胞乏氧應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。
　　二、Sorafenib抑制乏氧肝癌細(xì)胞活體致瘤能力的實(shí)驗(yàn)研究
　　材料和方法：
　　采用體外GFP（綠色熒光蛋白）轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，嘌呤霉素殺滅進(jìn)行 SMMC-7721-GFP穩(wěn)定細(xì)胞株篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá) GFP的SMMC-7721細(xì)胞株。將16只BALB/c裸鼠隨機(jī)分成4組，每組4只，用1ml

9、注射器于每只裸鼠背部皮下注射約2×106個接受不同條件處理的SMMC-7721-GFP細(xì)胞。A組裸鼠注射正常條件培養(yǎng)的SMMC-7721-GFP細(xì)胞；B組裸鼠注射乏氧培養(yǎng)的SMMC-7721-GFP細(xì)胞；C組裸鼠注射 sorafenib預(yù)處理后再乏氧培養(yǎng)的SMMC-7721-GFP細(xì)胞；D組裸鼠按照C組條件處理后的裸鼠再每日喂食sorafenib。對各組裸鼠分別在腫瘤接種的第2、9、16、23、30和40天時采用游標(biāo)卡尺體外測量裸鼠瘤灶

10、的長與寬，計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，40天后處死裸鼠，取出腫瘤稱重并進(jìn)行VEGF、CD34免疫組化染色。
　　結(jié)果：
　　嘌呤霉素殺滅曲線確定殺滅全部未感染病毒細(xì)胞的最小濃度為4ug/ml。按照此濃度的嘌呤霉素篩選4代獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的SMMC-7721細(xì)胞株，經(jīng)不同的預(yù)處理后注入裸鼠皮下成瘤。（1）腫瘤體積比較：成瘤第23天時D組裸鼠瘤體積較A組（對照組）明顯?。≒<0.05）；成瘤30天時，C組裸鼠瘤體積與A組相

11、比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；至成瘤40天時，D組及C組裸鼠的成瘤體積與A組相比差異均有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；B組裸鼠在各時間節(jié)點(diǎn)的成瘤體積上與A組相比差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（2）腫瘤重量比較：裸鼠成瘤40天時，D組裸鼠瘤重量明顯低于其他三組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而各組裸鼠的總體重在各個時間節(jié)點(diǎn)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（3）免疫組化結(jié)果比較：相對于A組，B組VEGF

12、及CD34的表達(dá)較A組略有增高，而C則較A組略有減低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；D組裸鼠相對于A組VEGF及CD34的表達(dá)明顯減低，差異均具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），顯示了sorafenib預(yù)處理及持續(xù)胃灌藥可以顯著抑制VEGF及CD34的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　?。?）通過構(gòu)建GFP熒光慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，通過嘌呤霉素篩選可以獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的SMMC-7721細(xì)胞

13、株。（2）裸鼠活體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，乏氧處理的瘤細(xì)胞隨著sorafenib作用時間的延長，抑瘤作用更加明顯。（3）基于成瘤標(biāo)本的VEGF與CD34免疫組化對照研究，進(jìn)一步驗(yàn)證了持續(xù)應(yīng)用sorafenib可通過抑制腫瘤的血管生成及粘附侵襲能力而達(dá)到聯(lián)合治療腫瘤的效果。
　　三、光學(xué)分子成像活體監(jiān)測成瘤生長及評價sorafenib早期療效的研究
　　材料和方法：
　　人肝癌SMMC-7721細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至70%融合后，按照實(shí)

14、驗(yàn)第一部分方法分成三組進(jìn)行預(yù)處理。12只BALB/c裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成4組，每組3只，在裸鼠背部皮下注射成瘤。A組裸鼠：注射正常條件培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞；B組裸鼠：注射乏氧培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞；C組裸鼠：注射sorafenib預(yù)處理后乏氧培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞；D組裸鼠：按照C組條件處理后的裸鼠再每日喂食sorafenib。對接種的裸鼠分別在腫瘤接種第2、9、16、23、30和40天在熒光活體成像儀（IV

15、IS LuminaⅡ）下進(jìn)行活體成像，通過熒光強(qiáng)度觀察腫瘤的生長情況及致瘤率，游標(biāo)卡尺測量裸鼠瘤灶的長與寬，計(jì)算腫瘤體積（mm3）并繪制腫瘤生長曲線。
　　皮下成瘤40天時采用熒光染料Cy5.5標(biāo)記的Annexin V注入裸鼠體內(nèi)，應(yīng)用小動物活體成像儀（IVIS LuminaⅡ）在480nm和520nm的條件下捕捉小鼠體內(nèi)發(fā)出的特異光子，進(jìn)行腫瘤凋亡顯像，通過IOD值反映腫瘤的凋亡情況并比較各組之間的凋亡差異。
　　結(jié)果：<

16、br>　?。?）活體光學(xué)顯像監(jiān)測成瘤情況：各組裸鼠成瘤情況通過吸光度值檢測結(jié)果顯示，皮下成瘤30天后可以通過吸光度值的測定較準(zhǔn)確的反映出種植瘤的生長變化情況，至40天時吸光度值測定結(jié)果顯示：A組和B組裸鼠的吸光度值基本一致，而C組的吸光度值則相對較小，D組的吸光度值最小，這四組的吸光度值變化趨勢與游標(biāo)卡尺體外測量的結(jié)果相符。（2）活體光學(xué)成像評價sorafenib早期治療腫瘤細(xì)胞凋亡情況：相對于對照組（A組），CoCl2乏氧處理組（B組

17、）和sorafenib預(yù)處理組（C組）的腫瘤細(xì)胞凋亡程度略有增高，但差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Sorafenib預(yù)處理后繼續(xù)胃灌藥組（D組）可以顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，吸光度值達(dá)到9.165×1010，與A組相比（吸光度值3.897×109）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　（1）GFP熒光標(biāo)記的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤情況可通過GFP活體熒光成像來顯示和監(jiān)測腫瘤的生長情況，