hTERT啟動子靶向性活體光學(xué)實時成像技術(shù)在腫瘤診斷及療效評估中作用的實驗研究.pdf

1、背景及目的:
　　 惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重疾病之一。惡性腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的早期診斷是患者預(yù)后的重要決定因素。在過去的幾十年中,醫(yī)學(xué)成像設(shè)備的發(fā)展使腫瘤診斷得到質(zhì)的提高,如超聲、計算機(jī)斷層掃描、磁共振成像等普遍而有效的檢查設(shè)備。但這些檢查方法并不能從本質(zhì)上區(qū)分病變的良惡性,而且對一些小的病灶不易發(fā)現(xiàn)。正電子發(fā)射斷層掃描是目前鑒別占位性病變良惡性的最佳方法,但PET有時對炎性占位和惡性腫瘤不易辨別。近年來新發(fā)展起來的腫瘤特異

2、性成像技術(shù),能夠借助腫瘤標(biāo)記物從根本上區(qū)分惡性腫瘤和正常組織。腫瘤特異性顯像技術(shù)是指利用惡性腫瘤的標(biāo)記物作為靶向元件,定向?qū)雸蟾婊蛉鐭晒獾鞍谆驘晒馑孛?使其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性的表達(dá),采用高敏的體外檢測設(shè)備捕獲瘤內(nèi)報告基因發(fā)出的熒光信號,從而對腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移以及對治療的反應(yīng)進(jìn)行實時無創(chuàng)的監(jiān)測。
　　 端粒酶是一種核糖核蛋白酶。人端粒酶主要由端粒酶RNA、端粒相關(guān)蛋白1和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶組成。近年來的研究表明,hTERT是

3、端粒酶復(fù)合物中的限速成分,與端粒酶一樣,它在絕大多數(shù)腫瘤中表達(dá),而在正常體細(xì)胞中少有表達(dá)。hTERT的這種腫瘤特異性表達(dá)的特性,使其成為近年來最受歡迎的廣譜腫瘤特異性標(biāo)記物,在腫瘤靶向的診斷及治療中受到越來越廣泛的應(yīng)用。由于hTERT的表達(dá)受hTERT啟動子的調(diào)控,基于hTERT的廣譜腫瘤特異性,hTERT啟動子也為許多研究者用于腫瘤靶向性診斷及治療的研究。有研究表明,hTERT啟動子的核心序列長約260bp,其中有含有一種E-box序

4、列,該序列可以和原癌基因c-myc家族編碼的一種螺旋-環(huán)-螺旋拉鏈基元蛋白因子結(jié)合而上調(diào)hTERT的表達(dá)。
　　 小動物無創(chuàng)活體顯像平臺是由高敏感CCD攝像探頭檢測動物體內(nèi)發(fā)出的微弱熒光信號。報告基因如GFP或luciferase在體內(nèi)發(fā)射出的熒光信號極弱,而且當(dāng)其透射出體外時往往伴有動物皮毛或糞便的自發(fā)熒光的干擾。
　　 基于以上分析,本研究采用hTERT啟動子作為腫瘤靶向性元件,為提高其在腫瘤細(xì)胞中的活性,降低其在正

5、常體細(xì)胞中的活性,根據(jù)文獻(xiàn)報道對其序列進(jìn)行優(yōu)化改建。在改建后的hTERT啟動子下游加載GFP報告基因,由可整合的慢病毒轉(zhuǎn)移至裸鼠的腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá),采用激光共聚焦或小動物熒光成像系統(tǒng),體內(nèi)外研究基于hTERT啟動子的慢病毒對惡性腫瘤的靶向性成像能力。在此基礎(chǔ)之上,將hTERT啟動子下游加載治療基因胞嘧啶脫氨酶和報告基因GFP同時表達(dá),將其構(gòu)建成hTERT啟動子靶向的治療慢病毒,并通過激光共聚焦或小動物熒光成像系統(tǒng),體內(nèi)外實時無創(chuàng)性研究基于

6、hTERT啟動子的治療性慢病毒對惡性腫瘤的靶向殺傷作用。為基于hTERT啟動子的活體光學(xué)實時成像技術(shù)在腫瘤診斷及治療效應(yīng)評估中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 研究方法
　　 1.hTERT啟動子設(shè)計及功能檢測:根據(jù)文獻(xiàn)優(yōu)化設(shè)計并合成hTERT啟動子,將其克隆到標(biāo)準(zhǔn)的啟動子功能檢測系統(tǒng)pGL3-basic質(zhì)粒中,同時構(gòu)建含CMV、SV40或野生型hTERT啟動子的對照組。采用雙熒光素酶實驗測定啟動子在端粒酶陽性或陰性的腫瘤細(xì)胞

7、以及原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中的活性,以確定優(yōu)化型hTERT優(yōu)化型啟動子的端粒酶靶向性。
　　 2.基于hTERT優(yōu)化型啟動子腫瘤靶向性活體光學(xué)成像在腫瘤診斷中作用的研究:采用第三代慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒作為骨架質(zhì)粒,將GFP報告基因克隆至其多克隆位點,構(gòu)建CMV啟動子驅(qū)動GFP表達(dá)的慢病毒載體;將hTERT優(yōu)化型啟動子替代CMV啟動子,構(gòu)建hTERT啟動子驅(qū)動GFP表達(dá)的慢病毒載體。四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)包裝并濃縮病毒,采用熒光定量PCR檢測病毒

8、滴度。體外實驗:將上述兩種慢病毒分別體外感染端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞或端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞和原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞,采用激光共聚焦觀察GFP的表達(dá);體內(nèi)試驗:構(gòu)建皮下生長端粒酶陽性或陰性的荷瘤裸鼠模型,并將上述兩種病毒分別瘤內(nèi)注射,采用活體成像系統(tǒng)觀察上述兩種慢病毒對腫瘤的靶向性顯像,進(jìn)一步采用組織化學(xué)技術(shù)檢測腫瘤組織內(nèi)GFP蛋白的表達(dá)。
　　 3.基于hTERT優(yōu)化型啟動子腫瘤靶向性活體光學(xué)成像在腫瘤治療效應(yīng)實時無創(chuàng)評估中作用的研究:

9、以pLenti-hTERTp-GFP作為骨架質(zhì)粒,在優(yōu)化型hTERT啟動子下游克隆CD自殺基因,以pLenti-hTERTp-GFP作為陰性對照。四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)包裝并濃縮病毒,采用熒光定量PCR檢測病毒滴度。體外實驗:將上述慢病毒體外感染端粒酶陽性和陰性的腫瘤細(xì)胞,并檢測GFP和CD的表達(dá);在感染了病毒的細(xì)胞內(nèi)加入CD前藥5-FC,并采用MTT實驗檢測細(xì)胞的存活率,以確定該治療型病毒在體外對細(xì)胞是否產(chǎn)生殺傷效應(yīng)。體內(nèi)試驗:構(gòu)建端粒酶陽性

10、和端粒酶陰性皮下荷瘤裸鼠模型,將上述兩種慢病毒分別瘤內(nèi)注射,感染后一周給裸鼠腹腔注射前藥5-FC,在活體成像儀下觀察病毒對腫瘤生長的抑制過程以及整體動物水平下腫瘤生長的特點,全程測量并記錄腫瘤體積的變化;進(jìn)一步組織學(xué)檢測腫瘤CD蛋白的表達(dá),激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1.雙熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)hTERT優(yōu)化型啟動子能夠在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)熒光素酶,且其表達(dá)水平與CMV、SV40啟動

11、子接近,略高于野生型hTERT啟動子;而在端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞和原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)熒光素酶。提示該優(yōu)化型hTERT啟動子具有在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)下游基因的能力,由于端粒酶在85％以上的惡性腫瘤中表達(dá),因此,hTERT優(yōu)化型啟動子可以作為腫瘤靶向元件用于腫瘤活體熒光成像。
　　 2.酶切及測序證實成功構(gòu)建了含有hTERT啟動子驅(qū)動GFP表達(dá)的慢病毒質(zhì)粒及CMV啟動子驅(qū)動GFP表達(dá)的對照質(zhì)粒。病毒包裝后檢測其滴度達(dá)

12、108數(shù)量。體外實驗發(fā)現(xiàn)pLenti-hTERTp-GFP慢病毒能夠在端粒酶陽性腫瘤的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP,而在端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞以及原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)GFP,而pLenti-CMVp-GFP慢病毒在端粒酶陽性及端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)均表達(dá)GFP,提示pLenti-hTERTp-GFP慢病毒具有明顯的端粒酶靶向性。體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn),pLenti-hTERTp-GFP慢病毒感染24小時后,采用活體光學(xué)成像系統(tǒng)在端粒酶陽性的荷瘤鼠中就能

13、觀察到瘤內(nèi)熒光,并持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)30天,熒光范圍和強(qiáng)度隨腫瘤的生長而擴(kuò)大增強(qiáng),能夠?qū)崟r反應(yīng)腫瘤的位置和大小以及有無轉(zhuǎn)移,而在端粒酶陰性的荷瘤鼠中則未見明顯熒光;對照慢病毒pLenti-CMVp-GFP感染后,在端粒酶陽性及端粒酶陰性荷瘤鼠中均可見熒光表達(dá)。組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)pLenti-hTERTp-GFP慢病毒感染后,只在端粒酶陽性的腫瘤內(nèi)有GFP蛋白的表達(dá),而端粒酶陰性腫瘤內(nèi)未見GFP蛋白表達(dá);而對照慢病毒pLenti-CMVp-GFP

14、感染后,在端粒酶陽性及端粒酶陰性腫瘤內(nèi)均可見GFP蛋白表達(dá)。
　　 3.酶切及測序證實成功構(gòu)建了含有hTERT啟動子驅(qū)動CD和GFP的慢病毒質(zhì)粒,以pLenti-hTERTp-GFP慢病毒作為空白對照。包裝病毒后檢測其滴度均達(dá)108數(shù)量級。體外研究發(fā)現(xiàn)pLenti-hTERTp-CD/GFP慢病毒感染細(xì)胞后,采用RT-PCR和Western blot技術(shù)在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)均可檢測到CD和GFP表達(dá),而在端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)

15、未檢測到CD和GFP的表達(dá):體外細(xì)胞殺傷實驗表明,pLenti-hTERTp-CD/GFP慢病毒感染細(xì)胞后能夠?qū)Χ肆Ｃ戈栃阅[瘤細(xì)胞產(chǎn)生顯著殺傷效應(yīng)。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)在端粒酶陽性的荷瘤鼠模型中,pLenti-hTERTp-CD/GFP慢病毒瘤體內(nèi)注射后,腫瘤生長速度明顯慢于pLenti-hTERTp-GFP慢病毒瘤體內(nèi)注射的腫瘤,而在端粒酶陰性腫瘤中,無論哪一種慢病毒瘤體內(nèi)注射,均不會影響腫瘤的生長;進(jìn)一步組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)在端粒酶陽性腫瘤中,p

16、Lellti-hTERTp-CD/GFP慢病毒瘤體內(nèi)注射的腫瘤,其CD和GFP均有表達(dá),而pLenti-hTERTp-GFP慢病毒瘤體內(nèi)注射的腫瘤僅有GFP蛋白表達(dá),在端粒酶陰性的腫瘤中,無論哪一種慢病毒瘤體內(nèi)注射,均未見CD和/或GFP的表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1.優(yōu)化后的hTERT啟動子具有很好的腫瘤靶向性?？梢宰鳛閺V譜腫瘤靶向元件,應(yīng)用于腫瘤的靶向顯像及靶向治療。
　　 2.含有優(yōu)化型hTERT啟動子驅(qū)動

17、GFP的慢病毒在體外和體內(nèi)均能感染腫瘤細(xì)胞,并在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)GFP。結(jié)合小動物活體成像平臺,該病毒能夠?qū)Χ肆Ｃ戈栃阅[瘤進(jìn)行無創(chuàng)的實時熒光成像,為腫瘤的早期特異性診斷和在體生物學(xué)行為研究提供依據(jù)。
　　 3.含有優(yōu)化型hTERT啟動子驅(qū)動CD和GFP的慢病毒能夠在體外和體內(nèi)感染腫瘤細(xì)胞,并在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)CD和GFP。在體外感染端粒酶陽性細(xì)胞后能對其產(chǎn)生顯著的殺傷效應(yīng)。瘤體內(nèi)注射后,能長期持續(xù)抑制端粒

18、酶陽性腫瘤的生長,結(jié)合活體熒光成像系統(tǒng),可以實時無創(chuàng)地觀察到自殺基因在腫瘤內(nèi)表達(dá)的范圍和強(qiáng)度,以及對腫瘤生長抑制的全部過程。
　　 以上研究顯示將hTERT啟動子進(jìn)行優(yōu)化改建后,在第三代慢病毒的攜帶下能夠在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)報告基因或(和)治療基因,結(jié)合小動物活體熒光成像系統(tǒng),能夠在動物整體水平對在體腫瘤進(jìn)行靶向性實時無創(chuàng)成像,為腫瘤的靶向性診斷及治療效果的實時無創(chuàng)評估提供了重要的實驗依據(jù)。由于端粒酶在85％以上的惡