Mst1在糖尿病心肌微血管損傷中的作用及機制研究.pdf

1、根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，截止至2015年，在全球范圍內，糖尿病患者數(shù)量總計為4.15億人，糖尿病前期患者數(shù)量為3.18億人。根據(jù)目前每年增長的速度來預計，如果不施以任何干預措施，至2040年，糖尿病患者數(shù)量總計將會達到6.42億人，而糖尿病前期人群數(shù)將達到4.81億人。近三十年來，我國糖尿病的患病率增加了17倍,從總人口數(shù)的0.67％增長至11.6%。
　　心血管（CV）并發(fā)癥在糖尿病患者的發(fā)病率和死亡率中占相當

2、大的比例。糖尿病心血管損傷的特點是內皮功能發(fā)生障礙。內皮是心血管系統(tǒng)的一個重要組成部分，它影響著微血管功能的許多方面，包括壓力、流量、滲透率、血管生成和血流變。糖尿病的血管內皮發(fā)生功能障礙會導致微血管病的相應臨床表現(xiàn)。然而，鮮為人知的是，與糖尿病相關的冠狀動脈微血管損傷的機制。因此，更好地了解糖尿病的發(fā)病機制和預防冠狀動脈微血管損傷是糖尿病管理中的核心問題。
　　內皮細胞作為葡萄糖和心肌細胞之間的屏障，在糖尿病相關的心血管疾病的發(fā)

3、病機制中起著重要的作用。在最近的研究中，自噬成為心血管疾病治療的一個潛在的新靶點，也有文獻證明了在防止糖尿病引起的腎小球硬化方面，內皮細胞和足細胞的自噬作用。然而，目前還沒有研究表明心肌微血管內皮細胞自噬在糖尿病中的作用。Mst1（哺乳動物STE20樣激酶1）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有不同的生物功能，包括細胞自噬、凋亡和氧化應激。據(jù)文獻報道，在心肌梗死小鼠模型中，Mst1通過抑制自噬來促進心臟功能障礙的發(fā)展。此外，研究也表明，通過抑

4、制Mst1基因能夠上調自噬，從而減輕梗死后心臟功能障礙。在心臟中，Mst1廣泛分布于心肌細胞和內皮細胞。Mst1基因可以直接抑制Beclin1活性，然而，Mst1/Beclin1信號通路在糖尿病冠狀動脈微血管損傷發(fā)展的直接作用機制并不清楚。
　　綜上所述，本研究分別從整體動物和細胞水平探討自噬在糖尿病心肌微血管損傷中的作用以及 Mst1/Beclin1信號通路在其損傷中的作用，為糖尿病心肌病變的診治提供新的思路。
　　【目的

5、】
　　1.構建轉基因小鼠糖尿病模型，分別觀察 Mst1基因敲除和 Mst1基因過表達的糖尿病小鼠心臟功能以及心肌微血管損傷情況。
　　2.分離培養(yǎng)心肌微血管內皮細胞，分別利用攜帶有 Mst1 shRNA的腺病毒和 Mst1的腺病毒干預細胞，觀察高糖條件下其對心肌微血管內皮細胞自噬水平的影響。
　　3.明確自噬在糖尿病心肌微血管損傷中的作用，證實Mst1/Beclin1信號通路介導的自噬在高糖誘導心肌微血管內皮細胞損傷

6、中的作用。
　　【研究方法】
　　1.將C57和Mst1?/?小鼠隨機分為四組：正常C57小鼠組（WT），Mst1基因敲除小鼠組（Mst1?/?），糖尿病小鼠組（DM），糖尿病Mst1基因敲除小鼠組(DM+Mst1?/?)。
　　2.將非轉基因小鼠和Mst1轉基因小鼠隨機分為四組：非轉基因小鼠組（NTg），Mst1轉基因小鼠組（Tg-Mst1），糖尿病非轉基因小鼠組（DM+ NTg），糖尿病Mst1轉基因小鼠組（DM+

7、NTg）。
　　3.按照50 mg/kg/d的標準構建糖尿病小鼠模型，鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射。造模成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)12周。
　　4.于12周末，超聲檢測各組小鼠心臟功能；掃描電鏡觀察各組小鼠心肌微血管連接的完整性（血管鑄型實驗）。
　　5.分離培養(yǎng)心肌微血管內皮細胞，利用攜帶有Mst1 shRNA(MOI:100)的腺病毒對細胞進行轉染，隨機分為以下6組：
　　A.對照組（5.5 mmol/L葡萄糖）：Co

8、n；
　　B.對照組（5.5 mmol/L葡萄糖）：Con+LacZ；
　　C. Mst1下調組（5.5 mmol/L葡萄糖）：Con+Ad-sh-Mst1；
　　D.高糖對照組（33 mmol/L葡萄糖）：HG；
　　E．高糖對照組（33 mmol/L葡萄糖）：HG+LacZ；
　　F．高糖Mst1下調組（33 mmol/L葡萄糖）：HG+Ad-sh-Mst1。
　　6.分離培養(yǎng)心肌微血管內皮細胞，

9、利用攜帶有Mst1(Ad-Mst1)(MOI:100)的腺病毒對細胞進行轉染，隨機分為以下6組：
　　A.對照組（5.5 mmol/L葡萄糖）：Con；
　　B.對照組（5.5 mmol/L葡萄糖）：Con+Ad-Control；
　　C. Mst1上調組（5.5 mmol/L葡萄糖）：Con+Ad-Mst1；
　　D.高糖對照組（33 mmol/L葡萄糖）：HG；
　　E．高糖對照組（33 mmol/L葡

10、萄糖）：HG+Ad-Control；
　　F．高糖Mst1上調組（33 mmol/L葡萄糖）：HG+Ad-Mst1。
　　7. Western blotting法檢測腺病毒轉染細胞后的Mst1基因表達水平。
　　8.心肌微血管內皮細胞中GFP-LC3的免疫熒光檢測。
　　9.心肌微血管內皮細胞中 p62/aggresome的免疫熒光檢測。
　　10.透射電鏡觀察心肌微血管內皮細胞中自噬小體的形態(tài)及數(shù)量。

11、r>　　11. TUNEL法檢測心肌微血管內皮細胞的凋亡。
　　12. JC-1染色檢測心肌微血管內皮細胞中線粒體膜電位水平。
　　13. Western blotting法檢測心肌微血管內皮細胞中sirt1、Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白分子表達水平。
　　【研究結果】
　　1. Mst1基因敲除（Mst1?/?）能夠改善糖尿病小鼠的心功能障礙，能夠改善糖尿病小鼠心肌微血管內皮連接的完整性。

12、r>　　2.過表達Mst1基因能夠加重糖尿病小鼠的心臟功能障礙，能夠加重糖尿病小鼠心肌微血管內皮連接完整性的破壞。
　　3. Mst1基因敲除可以上調心肌微血管內皮細胞的自噬水平，降低p62/aggresome的聚集，促進細胞自噬小體的生成，抑制高糖培養(yǎng)下心肌微血管內皮細胞的凋亡，并且能夠改善心肌微血管內皮細胞的線粒體膜電位水平。
　　4.過表達 Mst1基因可以下調心肌微血管內皮細胞中 LC3的表達，增加細胞中p62/ag

13、gresome的聚集，抑制細胞中自噬小體的生成，增加高糖培養(yǎng)下細胞的凋亡水平，并且能降低心肌微血管內皮細胞的線粒體膜電位水平。
　　5. Western結果顯示：Mst1基因的下調可以使 sirt1和 Beclin1蛋白的表達顯著增多；可以促進 LC3-Ⅱ表達，抑制 p62表達；可以引起自噬流的增強，BAF中LC3-II/LC3-1比值增加，p62表達降低。
　　6. Western結果顯示：Mst1基因的上調可以抑制sir

14、t1和Beclin1蛋白的表達；可以抑制LC3-Ⅱ表達，促進p62表達；可以抑制自噬流，BAF中LC3-II/LC3-1比值減少，p62表達增多。
　　【結論】通過本實驗，成功構建了轉基因小鼠糖尿病模型并分離培養(yǎng)出了小鼠心肌微血管內皮細胞，發(fā)現(xiàn)了Mst1基因敲除能減輕糖尿病導致的心功能障礙，減輕心肌微血管的病理損傷，增加心肌的自噬水平；Mst1過表達可以加重糖尿病導致的心功能障礙，加重心肌微血管的病理損傷，降低心肌的自噬水平，其機