鐵載體生物合成協(xié)同調(diào)控大腸桿菌中致病力相關(guān)特征代謝組.pdf

1、尿路感染（Urinary Tract Infection，UTI）作為臨床最常見的傳染性疾病之一，現(xiàn)已嚴(yán)重影響全球近60％的女性健康，其病源機(jī)制復(fù)雜、高復(fù)發(fā)和高耐藥的臨床屬性已經(jīng)嚴(yán)重制約其臨床有效診斷、治療和抗生素開發(fā)。研究證實，尿路感染80%的臨床病例是由致病性大腸染菌（Uropathogenic Escherichia Coli,UPEC）所誘導(dǎo)，鐵載體作為UPEC在宿主體內(nèi)生長繁殖和感染過程中所產(chǎn)生的一類具有攝取鐵元素功能的次生代

2、謝產(chǎn)物，已證其實合成與表達(dá)與大腸桿菌的致病力有著潛在的關(guān)聯(lián)，但關(guān)聯(lián)模式和機(jī)理尚不清晰。本課題首次應(yīng)用代謝組學(xué)－遺傳學(xué)整合策略，以致病型大腸桿菌E.coli83972（生物合成yesiniabactin，enterobactin，salmochelin和aerobactin四種鐵載體）和非致病性大腸桿菌 MG1655（僅合成保守型鐵載體enterobactin）為參考模型，圍繞致病性大腸桿菌與宿主尿液間是否存在有別于非致病性大腸桿菌與宿主

3、尿液間的特征性相互作用代謝組，致病大腸桿菌和非致病性大腸桿菌之間是否存在致病力相關(guān)的特征代謝組，以及鐵載體生物合成是否又如何調(diào)控這些與大腸桿菌致病力相關(guān)的特征代謝組等關(guān)鍵科學(xué)問題，從微生物系統(tǒng)代謝角度進(jìn)行全景式研究。
　　本研究首先對生物樣品前處理方法、NMR儀器分析與表征參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，并對大腸桿菌UPEC83972所編碼的四種鐵載體的基因簇(ybtS,entB,iroB,iucABCD)進(jìn)行排列組合式定點敲除以不同模式阻斷四

4、種鐵載體的生物合成，從而建立一套代謝組學(xué)－遺傳學(xué)整合策略以應(yīng)用于人體尿液和細(xì)菌細(xì)胞提取物中小分子代謝組的非靶向分析平臺?；谠撈脚_，對13組不同基因敲除型UPEC胞內(nèi)代謝組及經(jīng)過其培養(yǎng)過后的人體尿液（37位志愿者提供）代謝組進(jìn)行全景分析，并結(jié)合多種模式識別分析方法進(jìn)行差異性代謝物（特征代謝組）的發(fā)現(xiàn)與表征。最后參考多種網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)數(shù)據(jù)庫整合構(gòu)建特征代謝組的分子代謝通路，并深度結(jié)合已有的生物化學(xué)知識，理解鐵載體生物合成調(diào)控代謝修飾的生物學(xué)內(nèi)

5、涵。
　　本研究初步從UPEC與non-UPEC胞內(nèi)差異代謝組角度發(fā)現(xiàn)和鑒定23種特征代謝物，均與大腸桿菌的致病力直接相關(guān)，其中12種差異代謝物如甲基組氨酸、丙酮、苯乙酰甘氨酸、次黃嘌呤、鳥嘌呤、L-半胱氨酸、胸苷、乙酸吲哚、4-羥基苯基乙酸鹽、肌酸、富馬酸鹽和苯丙氨酸在UPEC中合成水平明顯升高；而NAD，腺嘌呤、丙氨酸、甲酸鹽、L-半胱氨酸、亮氨酸、胍基乙酸鹽、5-氨基戊酸、蘇氨酸、乳酸鹽和甘油酸鹽另11種特征差異代謝物的表達(dá)

6、水平則顯著降低。同理，本研究從大腸桿菌與宿主尿液共培養(yǎng)特征相互作用代謝組（互作代謝組）層面發(fā)現(xiàn)與表征31種與致病力密切相關(guān)的特征差異代謝產(chǎn)物，其中L-半胱氨酸、鯊肌醇、胞嘧啶、肌酐、香草醛、膽紅素、二氫胸腺嘧啶、苯甲醛、NADP,NAD,煙酰胺、硫胺素、表兒茶素和二氫尿嘧啶等14種差異代謝物尿液中表達(dá)水平在致病性大腸桿菌培養(yǎng)后明顯升高；而尿刊酸、富馬酸鹽、對氨基苯甲酸、對羥基苯基乙酸、尿苷5-單磷酸、4-羥基苯甲酸、3-羥基肉桂酸、反式

7、-2-羥基肉桂酸酯、間甲酚、鄰甲酚、對甲酚、4-氨基苯酚、N-甲基煙酰胺、苯基丙酮酸、脫氧腺苷、三磷酸鳥苷、吡哆醛和L-棕櫚酰肉堿等其它17種代謝物表達(dá)水平在培養(yǎng)后尿液中的表達(dá)水平顯著下降。最后，通過比較分析不同模式鐵載體生物合成即任一單阻斷、雙阻斷、三阻斷和四種鐵載體全阻斷對上述特征代謝組的調(diào)控作用，驚奇的發(fā)現(xiàn)上述兩個研究層面，任意單一鐵載體的生物合成被阻斷，對上述致病性相關(guān)特征代謝組均無明顯影響，但隨著鐵載體生物合成阻斷數(shù)量的增加，

8、鐵載體對特征代謝組的調(diào)控作用明顯增強(qiáng)。當(dāng)四種鐵載體生物合成完全阻斷時，致病性大腸桿菌與非致病性大腸桿菌的代謝組表型幾乎完全趨同，特征代謝組幾乎無明顯區(qū)分，由此我們有理由推斷鐵載體生物合成協(xié)同調(diào)控大腸桿菌中上述致病力相關(guān)的特征代謝組。
　　進(jìn)一步結(jié)合生物信息學(xué)分析和代謝通路數(shù)據(jù)檢索對已鑒定的上述致病力相關(guān)特征代謝組進(jìn)行隸屬代謝通路的歸屬分析，共標(biāo)定17條胞內(nèi)代謝通路貢獻(xiàn)UPEC致病力的形成，有16條代謝通路直接貢獻(xiàn)尿液互作代謝組對U

9、PEC致病力的調(diào)控作用，更重要的是這些代謝通路致病力的表達(dá)受到四種鐵載體生物合成的協(xié)同調(diào)控，他們主要覆蓋能量代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝和腸道微生物代謝等代謝通路，這些通路的表征和活性修飾分析有助于我們從微生物與人體系統(tǒng)共代謝角度探究尿路感染的發(fā)病機(jī)制，并為藥物發(fā)現(xiàn)提供新的科學(xué)基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本研究成功建立一套代謝組學(xué)和遺傳學(xué)整合分析策略，結(jié)果初步證實鐵載體生物合成對大腸桿菌胞內(nèi)致病力相關(guān)代謝組和與宿主尿液間的互作代謝組具有