柑橘碎葉病毒侵染性克隆構建及其誘導的基因沉默(VIGS)體系建立.pdf

1、柑橘是世界第一大水果。我國柑橘栽培面積超過290萬公頃，產量達3000萬噸，均居世界第一位。隨著克里曼丁紅橘（Citrus clementina Hort.exTan）和甜橙(C sinensis cv.Valencia)全基因組序列的公布，以及柑橘抗病、抗逆等相關基因序列表達標簽(Expressed sequence tags，EST)的大量累積，柑橘基因功能解析已成為目前的研究熱點和挑戰(zhàn)之一。病毒誘導的基因沉默(Virus-indu

2、ced gene silencing，VIGS)是近年來發(fā)展的一種基因功能研究工具，與轉基因、基因敲除、反義抑制等常用生物技術相比，試驗周期短，不需要遺傳轉化，具有操作簡便、成本低、高通量等優(yōu)勢。利用VIGS技術有望克服柑橘這種多年生木本作物童期長、遺傳轉化困難等瓶頸，加速其基因功能研究的進展。為此，本研究在柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus，CTLV）檢測方法及多態(tài)性研究的基礎上，篩選CTLV分離株進行全基

3、因組cDNA擴增、侵染性克隆構建，并進一步開展了在模式植物本生煙（Nicotiana benthamiana）上建立VIGS體系的研究，以期為在柑橘上實施VIGS進而研究其基因功能奠定基礎。主要研究結果如下:
　　 1.CTLV一步法及巢式RT-PCR檢測體系建立
　　 通過引物比對，建立了CTLV的一步法及巢式RT-PCR檢測體系。其中，一步法RT-PCR產物889bp，包含整個CP及3′UTR序列，比目前的常規(guī)RT-

4、PCR操作簡便，污染幾率小;巢式RT-PCR檢測靈敏度高，比一步法RT-PCR至少提高100倍，檢測模板總核酸的最低濃度約1.27pg/μL。
　　 2.CTLV多態(tài)性分析
　　 建立了CTLV分子變異的HinfⅠ/RFLP檢測體系，定義RFLP組群9個，發(fā)現CTLV以單一RFLP組群侵染為主，其中RFLPⅠ和RFLPⅡ組群可能是優(yōu)勢流行組群，但也存在混合侵染。該體系簡便、快速、重復性好，可用于大規(guī)模樣品的分子變異檢測。

5、
　　 對收集保存的18份CTLV分離株進行了指示植物鑒定、3′端序列分析及RFLP檢測。結果表明，在指示植物臘斯克枳橙(C sinensis×Poncirus trifoliata cv.Rusk)上表現弱到中等強度癥狀的6個分離株均屬于或攜帶有RFLPⅡ或RFLPⅢ組群，而其它RFLP組群均表現出強毒株特征。在根據3′端序列(889bp)構建的系統(tǒng)進化樹上，CTLV分離株聚為了2個同源性組群，同源性組群A包含的8個序列均為R

6、FLP Ⅱ或RFLP Ⅲ組群;同源性組群B則包含了其它RFLP組群的所有序列。同時，在指示植物上表現較弱癥狀的多數(4/6)CTLV分離物劃分在A組群，多數(10/12)CTLV強毒分離物則劃分在B組群。
　　 可見，指示植物上的弱（中）毒分離株侵染癥狀-RFLP Ⅱ或RFLP Ⅲ組群-同源性A組群三者之間可能存在某種內在聯系。RFLP組群檢測可用于研究CTLV的分子變異，對于快速鑒定CTLV致病性強弱可能具有參考價值。

7、　　 3.CTLV基因組全長cDNA擴增及序列分析
　　 在通過RACE技術獲得末端精確序列的基礎上，建立了CTLV全長的RT-PCR體系，進而擴增并克隆了CTLV新會橙分離株及滿頭紅分離株基因組全長cDNA。序列分析表明，CTLV-XHC（登錄號KC588947）和CTLV-MTH（登錄號KC588948）基因組全長均為6497nt[不包括3′poly(A)尾巴]，均包含2個開放讀碼框，在推定的CP及MP上游均具有保守的亞基

8、因組啟動子核心序列“UUAGGU”，與目前已報道的CTLV及蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)的基因組結構一致。
　　 同登錄GenBank的所有CTLV及ASGV全基因組序列比對顯示，CTLV-XHC與我國砂糖橘分離株CTLV-S序列一致性最高，為98％，在依據全基因組核苷酸序列構建的系統(tǒng)進化樹上，CTLV-XHC與柑橘來源的CTLV分離株聚為一簇;有趣的是，CTLV-MTH與日本AS

9、GV分離物序列一致性最高，為91％，而與臺灣甜橙分離株CTLV-LC一致性最低，為82.0％，在系統(tǒng)進化樹上CTLV-MTH與多數ASGV分離株聚為一簇。這一結果對于CTLV與ASGV的起源進化關系具有啟示意義。
　　 4.CTLV侵染性克隆構建
　　 對6個CTLV基因組全長cDNA克隆進行體外轉錄并摩擦接種昆諾藜（Chenopodium quinoa），癥狀觀察及RT-PCR檢測結果表明，CTLV-XHC和CTLV-

10、MTH的體外轉錄物具有侵染性。
　　 為獲得適于農桿菌介導接種的CTLV侵染性克隆，以pCAMBIA1301為骨架構建了雙元植物表達載體pCSSN:LB-2x35S-MCS-NOS-RB，通過瞬時表達GFP驗證其有效性后，采用分步克隆策略將CTLV-XHC和CTLV-MTH分別插入到pCSSN載體2x35S啟動子與NOS終止子之間。經篩選、鑒定獲得了CTLV侵染性克隆pCSSN-XHC和pCSSN-MTH。農桿菌介導的本生煙（N

11、.benthamiana）注射接種實驗表明，二者的侵染癥狀與野生型病毒對照無明顯差異，接種時共表達沉默抑制子p19提高了pCSSN-XHC和pCSSN-MTH的侵染率。
　　 5.CTLV誘導的VIGS體系建立
　　 以CTLV侵染性克隆pCSSN-XHC為基礎，通過重組克隆在CP終止子之后引入NruⅠ識別序列，構建了VIGS載體pCTLV-00:LB-2x35S-XHC(NruⅠ)-NOS-RB。反向插入402bp源于

12、本生煙的八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene desaturase，PDS)基因片段后，重組載體pCTLV-PDS402R通過農桿菌浸潤接種本生煙，在22℃光照16h和20℃黑暗8h周期條件下，誘導產生了PDS基因沉默的白化表型。Real-timeRT-PCR檢測結果表明，pCTLV-PDS402R侵染植株PDS基因的相對表達量比空載體pCTLV-00對照下降約25％。說明基于CTLV上的VIGS體系初步建立。
　　 為提高VI