草莓鑲脈病毒抑制沉默機(jī)制及其中國(guó)分離物侵染性鑒定.pdf

1、草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）ORF VI編碼的P6蛋白已證明是一個(gè)RNA沉默抑制子，能夠抑制ssGFP誘導(dǎo)的16c本氏煙（Nicotiana benthamiana16c line）局部沉默，但其抑制沉默的機(jī)制尚不明確。本課題研究P6抑制沉默的機(jī)制，明確P6不能抑制dsGFP誘導(dǎo)的基因沉默，亦不能局部回復(fù)已沉默16c本氏煙的GFP基因。本研究還克隆了SVBV沈陽(yáng)分離物（SVBV-S

2、Y）和SVBV北京分離物（SVBV-BJ）的全長(zhǎng)基因組；構(gòu)建了SVBV-SY和SVBV美國(guó)分離物（SVBV-US）的侵染性克隆，明確了2分離物侵染森林草莓（Fragaria vesca）引起的表型差異；構(gòu)建了P6基因移碼突變的SVBV-US侵染性克隆，證明P6是SVBV侵染森林草莓的必要基因；并構(gòu)建了SVBV病毒載體，能夠侵染森林草莓，為研究SVBV病毒基因和草莓基因的功能提供了研究工具。
　　1. SVBV P6不能抑制dsGF

3、P介導(dǎo)的RNA沉默
　　含重組質(zhì)粒pCAM-P6、pCAM-GFP和pCAM-dsGFP的農(nóng)桿菌混勻共浸潤(rùn)本氏煙，3天后在UV光下觀察發(fā)現(xiàn)，葉片浸潤(rùn)部位無(wú)明顯的綠色熒光，表明P6不能抑制dsGFP介導(dǎo)的RNA沉默。
　　2. SVBV P6不能局部回復(fù)已沉默的16c本氏煙
　　含重組質(zhì)粒pCAM-GFP的農(nóng)桿菌浸潤(rùn)16c本氏煙，30天后觀察發(fā)現(xiàn)，植株綠色熒光消失，呈均勻的紅色，GFP基因完全沉默。
　　含重組質(zhì)粒

4、 pCAM-P6的農(nóng)桿菌單獨(dú)浸潤(rùn)上述已沉默的16c本氏煙，3 d后在UV光下觀察發(fā)現(xiàn)，葉片浸潤(rùn)部位無(wú)明顯綠色熒光。含重組質(zhì)粒pCAM-P6的農(nóng)桿菌與含重組質(zhì)粒pCAM-GFP的農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)已沉默的16c本氏煙，3 d后在UV光下觀察發(fā)現(xiàn)，葉片浸潤(rùn)部位亦不出現(xiàn)明顯的綠色熒光。說(shuō)明SVBV P6蛋白不能局部回復(fù)已沉默的16c本氏煙。
　　3. SVBV沈陽(yáng)分離物和SVBV北京分離物全長(zhǎng)基因組的克隆
　　采集感染 SVBV的草莓樣

5、本，提取總 DNA。以此為模板，PCR分段擴(kuò)增出SVBV-SY和SVBV-BJ片段，拼接獲得全長(zhǎng)基因組克隆pSVBV-SY和pSVBV-BJ。SVBV-SY基因組序列全長(zhǎng)7864 bp，序列登錄號(hào)為KP311681。SVBV-BJ基因組序列全長(zhǎng)7863 bp，序列登錄號(hào)為KR080547。
　　比對(duì)基因組全序列發(fā)現(xiàn)，SVBV-SY與SVBV-BJ全長(zhǎng)基因組序列相似性很高，達(dá)到97.8％，2分離物與已報(bào)道的SVBV其他分離物全長(zhǎng)基因

6、組序列相似性較高，達(dá)85.7%~94.2%，而與花椰菜花葉病毒屬（Caulimovirus）其他成員全長(zhǎng)基因組序列相似性較低，僅為43.5%~45.9%。進(jìn)一步比對(duì)分析SVBV-SY和SVBV-BJ各ORFs核苷酸序列與已報(bào)道的SVBV其他分離物各ORFs核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)ORF II序列變異最大，相似性為74.3%~75.1%，而ORF V序列變異最小，相似性高達(dá)88.8%~97.6%。
　　4. SVBV-SY和SVBV-US侵

7、染性克隆的構(gòu)建及其侵染性鑒定
　　利用 SVBV全長(zhǎng)基因組克隆 pSVBV-E3構(gòu)建 SVBV-US侵染性克隆pBIN-1.25SVBV-US，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101，接種森林草莓（F. vesca）、栽培草莓（F.× ananassa）、普通煙（Nicotiana tabacum）、本氏煙（N. benthamiana）、三生煙（N. tabacum var. Samsun NN）和心葉煙（N. glutinosa）驗(yàn)證侵染性

8、。8周后觀察發(fā)現(xiàn)，接種SVBV-US侵染性克隆的森林草莓表現(xiàn)明顯的葉脈鑲邊黃化癥狀。而接種SVBV-US侵染性克隆的栽培草莓和4種煙草屬植物均未表現(xiàn)明顯癥狀。PCR檢測(cè)表明，SVBV-US侵染性克隆能高效侵染森林草莓和栽培草莓，而不能侵染4種煙草屬植物。
　　利用 SVBV全長(zhǎng)基因組克隆 pSVBV-SY構(gòu)建 SVBV-SY侵染性克隆pBIN-1.25SVBV-SY，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，接種森林草莓和栽培草莓驗(yàn)證侵染性。8周后

9、觀察發(fā)現(xiàn)，接種SVBV-SY侵染性克隆的森林草莓表現(xiàn)葉片扭曲、提前開(kāi)花、植株衰弱癥狀。而接種SVBV-SY侵染性克隆的栽培草莓不表現(xiàn)明顯癥狀。PCR檢測(cè)表明，SVBV-SY侵染性克隆能夠高效侵染森林草莓，但不能侵染栽培草莓。
　　5. SVBV-US P6移碼突變侵染性克隆的構(gòu)建及其侵染性驗(yàn)證
　　移碼突變SVBV-US P6，獲得含有突變的SVBV全基因組克隆pSVBV（ΔP6）。進(jìn)一步構(gòu)建得到 P6移碼突變的侵染性克隆

10、pBIN-1.25SVBV（ΔP6），轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，接種森林草莓驗(yàn)證侵染性。8周后觀察發(fā)現(xiàn)，森林草莓不表現(xiàn)明顯癥狀， PCR未檢出SVBV cp基因。說(shuō)明P6移碼突變侵染性克隆不能侵染森林草莓。
　　6. SVBV病毒載體的構(gòu)建
　　將多克隆位點(diǎn)插入缺失ORF II的pSVBV-E3，獲得重組載體pSVBV-MCS。再進(jìn)一步構(gòu)建SVBV病毒載體pBIN-1.2SVBV-MCS，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，接種森林草莓驗(yàn)