果蠅Mre11精氨酸突變動(dòng)物模型的建立及G2-M檢驗(yàn)點(diǎn)檢測(cè).pdf

1、在生物體中，DNA不斷受到內(nèi)源和外源損傷因子的威脅。為了保護(hù)遺傳信息的完整，細(xì)胞在生物進(jìn)化過(guò)程中形成了一整套復(fù)雜的監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)，用以監(jiān)測(cè)基因組的完整性，稱為DNA損傷應(yīng)答。該網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測(cè)DNA損傷的存在，傳遞損傷信號(hào)，實(shí)現(xiàn)多步的生物學(xué)反應(yīng)，包括細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷修復(fù)、端粒維持和細(xì)胞凋亡等。MRN復(fù)合物（酵母中MRX）由Mre11、Rad50和Nbs1（Xrs2）組成，是DNA損傷應(yīng)答的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，參與細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)和損傷修復(fù)的各個(gè)方

2、面。MRN復(fù)合物可以結(jié)合在染色體DNA上，識(shí)別雙鏈斷裂，發(fā)出損傷信號(hào)，并在DNA修復(fù)起著重要的作用。研究表明，MRN復(fù)合物突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤或衰老相關(guān)疾病的發(fā)生。Mre11是MRN復(fù)合物極其重要的成員之一。到目前為止，關(guān)于Mre11的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究。Mre11是一種高度保守的70 kDa大小的蛋白，它的N端具有Mn2+/Mg2+依賴性磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域，中部具有一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端含有一個(gè)甘氨酸-精氨酸富集區(qū)（Glycin

3、e and Arginine-Rich，GAR）。Mre11的主要功能包括單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)核酸內(nèi)切酶活性、3'–5'雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）核酸外切酶活性、較弱的DNA解旋酶活性及雙鏈斷裂修復(fù)和激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的功能。研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠mre11引起小鼠胚胎致死。人的mre11基因突變導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張樣疾?。ˋtaxia Telangiec

4、tasia Like Disorder，ATLD），患者典型表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、神經(jīng)退行性病變、免疫缺陷及癌癥易發(fā)等。研究Mre11的功能將有助于人們了解相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。Mre11 GAR區(qū)域富含精氨酸，可以被蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT1甲基化，調(diào)節(jié)Mre11的功能。研究發(fā)現(xiàn)，盡管Mre11 GAR區(qū)精氨酸的甲基化不影響ATM信號(hào)通路的激活和MRN復(fù)合物的形成及定位，但是對(duì)于Mre11核酸外切酶活性的維持、細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的激活及雙鏈斷

5、裂損傷的修復(fù)至關(guān)重要。
　　我們實(shí)驗(yàn)室以果蠅為動(dòng)物模型，長(zhǎng)期致力于DNA損傷應(yīng)答的研究。前期工作中成功建立了mre11缺失的果蠅株，發(fā)現(xiàn)mre11缺失的果蠅死于成蛹晚期，為研究Mre11的體內(nèi)生物學(xué)功能提供了較為理想的動(dòng)物模型。前期研究將Mre11蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Mre11的GAR區(qū)域較為保守；體外甲基化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)果蠅Mre11蛋白可以被果蠅精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（Drosophila Arginine Methyltrans

6、ferase1，DART1）甲基化；Mre11與DART1之間存在蛋白質(zhì)間的相互作用，且這種相互作用不依賴GAR區(qū)域；為了進(jìn)一步確定GAR區(qū)域精氨酸甲基化情況，針對(duì)GAR區(qū)域六個(gè)精氨酸位點(diǎn)分別制備了相應(yīng)的位點(diǎn)特異性甲基化抗體，發(fā)現(xiàn)R559、R563、R565、R569四個(gè)位點(diǎn)可被甲基化。
　　為了進(jìn)一步研究果蠅Mre11精氨酸甲基化在DNA損傷應(yīng)答中的功能，本研究采用經(jīng)典的果蠅Ends-In方法，建立了mre114個(gè)甲基化位點(diǎn)的點(diǎn)