魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120中PrpJ1和PrpJ2在細(xì)胞氧化脅迫響應(yīng)中的作用及其底物和互作蛋白研究.pdf

1、魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120(Anabaena sp. strain PCC7120)是一種光能自養(yǎng)的革蘭氏陰性細(xì)菌，是研究細(xì)胞發(fā)育和信號(hào)傳導(dǎo)的模式生物。在環(huán)境中缺乏化合態(tài)氮源的情況下，魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120菌絲上5％-10%的細(xì)胞會(huì)分化為專(zhuān)一執(zhí)行生物固氮功能的異形胞，維持整條菌絲的生長(zhǎng)。在魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120中prpJ1和prpJ2編碼PP2C類(lèi)的蛋白磷酸酶，二者氨基酸序列高度同源。prpJ1的缺失導(dǎo)致缺氮后異形胞發(fā)育不完整，缺少一

2、種異形胞特異性糖脂。prpJ2的缺失對(duì)異形胞發(fā)育沒(méi)有顯著的影響，但是prpJ1和prpJ2的同時(shí)缺失則影響了異形胞發(fā)育的主要調(diào)控因子HetR的正常表達(dá)，并導(dǎo)致異形胞完全不能發(fā)育。同時(shí)，初步研究顯示prpJ1和prpJ2可能參與細(xì)胞的抗氧化脅迫。本研究的目的是確定prpJ1和prpJ2參與魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120的氧化脅迫響應(yīng)過(guò)程，并尋找PrpJ1和PrpJ2蛋白的底物或者互作蛋白，以進(jìn)一步研究prpJ1和prpJ2在異形胞發(fā)育和氧化脅迫

3、響應(yīng)過(guò)程中的作用機(jī)制。
　　 本研究用甲基紫精(MV)作為氧化劑檢測(cè)prpJ1的突變體S20、prpJ2的突變體S19，以及雙基因突變體S19/S20的氧化脅迫耐受性，結(jié)果顯示S19和S20對(duì)MV有一定的耐受性，而雙突變體S19/S20具有顯著的比野生型更強(qiáng)的對(duì)MV脅迫的耐受性。qPCR結(jié)果顯示，在H2O2(10mmol/L)和MV(100μ mol/L)的氧化脅迫下，魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120野生型中prpJ1和prpJ2基因均

4、顯著的下調(diào)表達(dá)，其中prpJ1在H2O2脅迫下的基因表達(dá)下調(diào)更高達(dá)10倍以上。由此推測(cè)這兩個(gè)基因在魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120抗氧化脅迫過(guò)程中具有一定的協(xié)同調(diào)節(jié)作用。
　　 本研究通過(guò)Pull-Down和二維電泳這兩種技術(shù)來(lái)尋找PrpJ1和PrpJ2蛋白的底物或者相互作用蛋白。在Pull-Down實(shí)驗(yàn)中，本研究首先獲得以6×His-Tag標(biāo)記的活性蛋白PrpJ1upN和PrpJ2upC。PrpJ1upN和PrpJ2upC均缺少了跨膜

5、區(qū)和C段區(qū)域。體外酶活檢測(cè)顯示，二者仍具有蛋白磷酸酶活性。分別以這兩個(gè)蛋白作為誘餌蛋白，從不同培養(yǎng)條件下（硝酸鹽或氮源缺乏）魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120菌株(WT或S20或S19)總蛋白中釣取與之相互作用的蛋白。經(jīng)過(guò)多次檢測(cè)，本研究沒(méi)有獲得特異性的互作蛋白。但在研究中發(fā)現(xiàn)，氮源缺乏24后S20突變體中PrpJ1可能存在特異性降解。同時(shí)我們提取了魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌WT，S20及S19氮源缺乏條件下的磷酸化蛋白，利用二維電泳技術(shù)，比較WT與S20或S1