CD39+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)與乙肝慢加急肝衰竭(ACLF)的相關(guān)性研究.pdf

1、乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性疾病，發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界大約有2.8億人慢性感染乙型肝炎病毒，在我國(guó)就占了1.3億。每年我國(guó)大約有2千萬(wàn)乙型肝炎病毒慢性感染者發(fā)病，約有40萬(wàn)人死于乙肝病毒相關(guān)的肝衰竭、肝硬化以及肝癌。國(guó)家每年要花大量的醫(yī)療經(jīng)費(fèi)用于乙肝患者的治療，乙肝問(wèn)題已成為我國(guó)急需解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。
　　 乙肝慢加急肝衰竭(Acute on Chronic liver fail

2、ure，ACLF)是在慢性乙型肝炎的基礎(chǔ)上，由于多種因素作用下，肝組織破壞急性加重，大量肝組織細(xì)胞壞死，導(dǎo)致肝功能衰竭[2]，同時(shí)并發(fā)肝性腦病、肝腎綜合征、消化道出血、感染等嚴(yán)重并發(fā)癥，病死率極高。目前研究表明慢加急肝衰竭發(fā)病機(jī)制可能與HBV病毒復(fù)制、宿主免疫反應(yīng)以及感染等多種因素有關(guān)，但確切機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。近年來(lái)，臨床研究提示患者體內(nèi)免疫功能失調(diào)可能是造成慢加急肝衰竭肝組織嚴(yán)重?fù)p傷的機(jī)制之一[3]。
　　 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(R

3、egulatory T cells，Treg)是一類(lèi)具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)細(xì)胞群，其特征性標(biāo)記物為CD4+CD25+FoxP3+，具有免疫低反應(yīng)性和免疫抑制性?xún)纱蠊δ芴卣鱗4]。研究已證實(shí)Treg的數(shù)量及功能改變與很多疾病如自身免疫性疾病、腫瘤及感染性疾病等密切相關(guān)[5-12]。最近研究發(fā)現(xiàn)CD39+FoxP3+Treg細(xì)胞可能是Treg中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的主要細(xì)胞群。CD39是細(xì)胞外三磷酸腺苷(ATP)水解酶家族成員之一，其作用在于水

4、解細(xì)胞外的三磷酸腺苷/二磷酸腺苷( ATP/ADP)。ATP是細(xì)胞損傷的指示劑，細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度很高，細(xì)胞損傷后，細(xì)胞內(nèi)大量的ATP釋放到細(xì)胞外，ATP被嘌呤P2受體識(shí)別后誘發(fā)主要的炎癥前反應(yīng)。CD39通過(guò)滅活A(yù)TP，抑制由ATP誘發(fā)的炎癥反應(yīng)[13]。目前研究發(fā)現(xiàn)CD39主要表達(dá)于FxoP3+Treg細(xì)胞膜外，并且其在Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮非常重要的作用。國(guó)外研究證實(shí)，CD39+FoxP3+Treg細(xì)胞免疫抑制功能顯著強(qiáng)于

5、CD39-FoxP3+Treg細(xì)胞，并且和多種疾病的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)?，F(xiàn)已證實(shí)，不同疾病進(jìn)程的多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量與健康人差異不大，但兩者間CD39在Treg細(xì)胞胞外的表達(dá)比例存在顯著差異，MS復(fù)發(fā)的患者外周血中FoxP3+Treg細(xì)胞CD39的表達(dá)比例明顯低于處于穩(wěn)定狀態(tài)的MS患者以及健康人[14]。
　　 HBV慢性感染的特點(diǎn)是其病毒特異性免疫反應(yīng)微弱，目前認(rèn)

6、為乙型肝炎的慢性活動(dòng)狀態(tài)與異常的免疫耐受有關(guān)，但免疫耐受的機(jī)制目前尚不清楚。Treg細(xì)胞可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能，近年的研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在抗HBV特異性免疫反應(yīng)損傷中發(fā)揮著重要的作用。但CD39+Treg細(xì)胞是否參與了乙肝慢加急肝衰竭的發(fā)病過(guò)程目前在國(guó)內(nèi)、外還未見(jiàn)報(bào)道。
　　 為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)CD39+Treg細(xì)胞與乙肝慢加急肝衰竭的發(fā)病關(guān)系，我們首先對(duì)健康人外周血CD39+Treg細(xì)胞的表型及功能特點(diǎn)進(jìn)行分析，比較了乙肝慢加

7、急肝衰竭患者與健康人外周血CD39+Treg細(xì)胞的變化情況，對(duì)比乙肝慢加急肝衰竭存活組和死亡組外周血CD39+Treg細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞比例的差異，通過(guò)功能試驗(yàn)驗(yàn)證了CD39+Treg細(xì)胞的抑制功能。本研究具體的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果有以下幾個(gè)方面。
　　 一健康人外周血CD39+FoxP3 +Treg細(xì)胞的表型鑒定
　　 為了探討CD39+Treg細(xì)胞與乙肝慢加急肝衰竭的關(guān)系，我們首先檢測(cè)了健康人外周血的Treg細(xì)胞表型，

8、FACS結(jié)果顯示以CD39作為標(biāo)志物，可以將FoxP3+Treg細(xì)胞分成CD39+FoxP3+Treg和CD39 - FoxP3+Treg兩群細(xì)胞，CTLA-4、HLA-DR、CD45RO、Ki-67等表面標(biāo)記物在CD39+FoxP3+Treg細(xì)胞的表達(dá)明顯高于CD39-FoxP3+Treg細(xì)胞。上述結(jié)果為我們下一步的功能試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 二健康人外周血CD39+FoxP3+Treg細(xì)胞的功能分析
　　 Treg細(xì)

9、胞的鑒定除了表型外，更重要的是體內(nèi)或體外環(huán)境下是否發(fā)揮抑制功能。本部分分別對(duì)CD39+FoxP3+Treg和CD39-Fxop3+Treg細(xì)胞抑制PBMC增殖和IFN-γ,分泌的能力進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示表達(dá)CD39的FoxP3+Treg細(xì)胞抑制細(xì)胞增殖功能明顯強(qiáng)于不表達(dá)CD39的FoxP3+Treg細(xì)胞，且明顯抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ的分泌。
　　 三健康人和乙肝慢加急肝衰竭患者外周血中CD39+FoxP3+Treg細(xì)胞的

10、變化比較
　　 為了明確CD39+FoxP3+Treg細(xì)胞與乙肝慢加急肝衰竭發(fā)病是否密切相關(guān)，我們比較健康人和乙肝慢加急肝衰竭患者外周血中CD39+FoxP3+Treg細(xì)胞比例的情況，對(duì)比乙肝慢加急肝衰竭存活組和死亡組外周血CD39+Treg細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞比例的差異。結(jié)果顯示，乙肝慢加急肝衰竭患者外周血中CD39+FoxP3+Treg細(xì)胞比例明顯高于健康人，乙肝慢加急肝衰竭存活組外周血CD39+FoxP3+Treg細(xì)胞占