長(zhǎng)期施肥對(duì)水稻土亞硝酸還原酶基因(nirK、nirS)多樣性的影響.pdf

1、反硝化作用是造成土壤氮素?fù)p失的主要途徑之一,不僅導(dǎo)致氮肥利用率降低,同時(shí)增加溫室氣體N2O的排放量,破壞大氣臭氧層,加速全球氣候變暖,對(duì)環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重影響。長(zhǎng)期施肥對(duì)稻田土壤反硝化作用有重要影響,化肥尤其是氮肥的大量投入,促進(jìn)了反硝化作用,提高了N2O的排放量。以反硝化過(guò)程中的關(guān)鍵功能基因——亞硝酸還原酶編碼基因(nirK、nirS)為分子標(biāo)記,探討施肥對(duì)反硝化菌群落多樣性的影響,有助于提高稻田系統(tǒng)氮素利用率,減少溫室氣體排放和環(huán)境污染,

2、為稻田生產(chǎn)力可持續(xù)性發(fā)展提供重要理論依據(jù)。
　　 本研究利用中國(guó)科學(xué)院桃源農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站始于1990年的長(zhǎng)期施肥試驗(yàn),選取不施肥(CK)、施氮肥(N)、平衡施化肥(NPK)、有機(jī)肥配施化肥(NPKOM)四種不同施肥處理的土壤樣品,利用分子生物學(xué)技術(shù),研究了不同施肥處理對(duì)水稻土亞硝酸還原酶基因nirK、nirS多樣性的影響。研究通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,采用降落式PCR擴(kuò)增目的基因。目的片段用pGEM-T載體連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5α

3、中,通過(guò)藍(lán)白斑篩選克隆進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,構(gòu)建nirK、nirS基因克隆文庫(kù),計(jì)算多樣性指數(shù)、繪制Chaol預(yù)測(cè)曲線,進(jìn)行LIBSHUFF分析及系統(tǒng)發(fā)育分析。主要結(jié)果如下:
　　 1)長(zhǎng)期不同施肥對(duì)土壤反硝化速率產(chǎn)生了不同影響,NPKOM處理的反硝化速率顯著高于其他三個(gè)處理,N處理次之。NPK處理的反硝化速率高于CK處理,但沒有顯著差異。
　　 2)根據(jù)Chaol預(yù)測(cè)分析,長(zhǎng)期不同施肥對(duì)nir基因多樣性的影響不一致。

4、NPK處理比N和NPKOM處理更有利于提高含nirK基因反硝化菌群落的多樣性,而N處理使nirS基因的多樣性顯著提高。
　　 3)利用LIBSHUFF方法分析不同施肥的基因文庫(kù)差異,發(fā)現(xiàn)nirK基因四個(gè)處理間兩兩比較的差異都達(dá)到顯著水平,而nirS基因的處理間則無(wú)顯著差異。表明長(zhǎng)期施肥明顯改變了含nirK基因的反硝化菌的群落結(jié)構(gòu),對(duì)nirS基因群落結(jié)構(gòu)影響較小。
　　 4)本研究克隆的249個(gè)nirK基因序列有232個(gè)與

5、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知nirK基因片段相似,nirS基因克隆只有79％與已知序列相似。nirK基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中未知菌種的nirK基因相似性較高,為80％～95％,平均達(dá)90.7％；而nirS基因片段與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的nirs基因相似度低,為72％～82％,平均為74.7％。因此無(wú)法判斷本研究克隆得到的nirK、nirS基因片段所屬的菌種。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,nirK基因的OTUs可分為8個(gè)大簇,且不同處理下的OTUs有聚集情況,表明施肥

6、改變了nirK反硝化菌群落中優(yōu)勢(shì)種的分布。大多數(shù)nirS基因克隆聚集在一個(gè)主要的大簇中,不同處理的OTUs分布則較平均,無(wú)明顯的聚集情況,顯示其群落的穩(wěn)定性。
　　 總體來(lái)說(shuō),長(zhǎng)期不同施肥對(duì)水稻土nirK、nirS基因反硝化菌群落多樣性的影響不一致,平衡施化肥明顯提高nirK基因多樣性,單施氮肥使nirS基因多樣性達(dá)到最高,其他施肥處理對(duì)nir基因多樣性的影響不顯著。施肥明顯改變了nirK基因群落的結(jié)構(gòu)組成,但對(duì)nirS基因群落