預(yù)知子提取物的質(zhì)量控制及其抗抑郁藥效-藥動(dòng)學(xué)研究.pdf

1、目的:提取分離藥材預(yù)知子(Fructus Akebiae)中抗抑郁活性成分,測(cè)定預(yù)知子提取物(Fructus Akebiae Extract,FAE)主要成分常春藤皂苷元(hederagenin),齊墩果酸(Oleanolic acid,OA),熊果酸(Ursolic acid,UA)含量,對(duì)預(yù)知子提取物的溶劑殘留及重金屬進(jìn)行檢測(cè),初步研究FAE質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。建立檢測(cè)大鼠血漿及腦脊液中常春藤皂苷元的超快速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UFLC-

2、MS/MS)方法,初步闡明預(yù)知子中抗抑郁活性成分常春藤皂苷元的藥代動(dòng)力學(xué)。建立抑郁相關(guān)的行為絕望模型,對(duì)預(yù)知子提取物及常春藤皂苷元抗抑郁活性的藥效學(xué)篩選,明確預(yù)知子中抗抑郁活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 方法:(1)藥材預(yù)知子中抗抑郁活性成分提取:以預(yù)知子藥材為原料,先進(jìn)行脫脂處理,再依次進(jìn)行80％乙醇、乙酸乙酯和水飽和正丁醇提取后得預(yù)知子總皂苷,將所得總皂苷經(jīng)含酸乙醇降解及純化處理后得預(yù)知子提取物(FAE)。并采用UFLC-MS/MS

3、法,對(duì)FAE中的主要化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)解析,測(cè)定其主要成分常春藤皂苷元,齊墩果酸,熊果酸含量。(2)FAE中有機(jī)溶劑的殘留量檢測(cè):采用自動(dòng)頂空GC-MS法,用RxiTM-5ms(30m×0.25mm,0.25μm)毛細(xì)管色譜柱,優(yōu)化頂空條件,以叔丁醇為內(nèi)標(biāo)。參照中國(guó)藥典(2010年)中的相關(guān)規(guī)定,測(cè)定了預(yù)知子提取過(guò)程中使用的三種有機(jī)溶劑.乙醇、乙酸乙酯、正丁醇的殘留量(3)預(yù)知子藥材及FAE中5種有害重金屬的測(cè)定:微波消解,以鍺(Ge)、

4、銦(In)、鉍(Bi)作為內(nèi)標(biāo),補(bǔ)償基體效應(yīng),采用ICP-MS同時(shí)測(cè)定砷、鉛、汞、鎘、銅5種元素。(4)①采用UFLC-MS-MS法測(cè)定大鼠血漿與腦脊液中常春藤皂苷元的濃度。血漿樣品選用甲醇沉淀蛋白處理,而腦脊液用乙酸乙酯萃取,然后N2吹干濃縮,以異戊巴比妥為內(nèi)標(biāo),選用XR-ODS II(75 mm×2.0 mm,i.d.,2.1μm)柱進(jìn)行分離,流動(dòng)相為5 mM醋酸銨和乙腈(v/v)梯度洗脫,流速0.35 mL/min。通過(guò)電噴霧離子

5、化,負(fù)離子檢測(cè),優(yōu)化質(zhì)譜條件,常春藤皂苷元的定量離子m/z471.5→393.4,內(nèi)標(biāo)異戊巴比妥定量離子m/z225→182?？疾炝藰悠吩诟鞣N儲(chǔ)藏條件下,如長(zhǎng)期(-20℃,7d)、短期(25℃,4h)、凍融(n=3)以及樣品處理后的穩(wěn)定性,同時(shí)也考察了方法的回收率、基質(zhì)效應(yīng)、精密度、準(zhǔn)確度。②常春藤皂苷元藥代動(dòng)力學(xué)探索:SD大鼠,按100 mg/kg、400 mg/kg兩個(gè)劑量,單次給藥,分別在0,5,10,15,20,30,60,90

6、,120,150,180,210,240,300 min采集血樣備用。腦脊液樣品,分別在給藥前與給藥后20 min采集備用。運(yùn)用DAS2.1.1軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。(5)FAE抗抑郁的作用:①建立皮質(zhì)酮(corticosterone,Cor)損傷的PC12細(xì)胞模型,觀察常春藤皂苷元對(duì)照品和預(yù)知子提取物(FAE)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力的影響。②建立抗抑郁活性的藥效學(xué)初篩模型,雄性昆明小鼠隨機(jī)分成5組,即溶劑對(duì)照[0.5％羧甲基纖維素鈉(

7、CMC-Na)溶液]組、hederagenin(10mg/kg、50mg/kg)組、FAE(100mg/kg)組、草酸-S-西酞普蘭(escitalopram,ESC)陽(yáng)性對(duì)照(6.25 mg/kg)組,各組動(dòng)物每日灌胃1次,每次0.2 mL/10g,連續(xù)給藥7天。建立小鼠的行為絕望模型,末次給藥24小時(shí)后分別進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(the forced swimming test,FST)和懸尾實(shí)驗(yàn)(the tail suspension

8、test,TST)不動(dòng)時(shí)間記錄,以及自主活動(dòng)計(jì)數(shù)。
　　 結(jié)果:(1)FAE中含約70％的常春藤皂苷元及少量的齊墩果酸和熊果酸,在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)三種化合物對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好,三批樣品中平均含量常春藤皂苷元為70.60％±2.29％；齊墩果酸為2.09％±0.12％,熊果酸為5.32％±0.10％。(2)自動(dòng)頂空GC-MS法檢測(cè)FAE中有機(jī)溶劑的殘留量:結(jié)果三批預(yù)知子提取物中乙酸乙酯與正丁醇均未檢出,乙醇平均百分含量:從0

9、.14％(RSD,4.6％)-0.31％(RSD,3.9％)(n=3)。結(jié)果顯示預(yù)知子提取物中乙醇?xì)埩艟陀?.5％,符合《中國(guó)藥典》2010版的溶劑殘留標(biāo)準(zhǔn)。(3)ICP-MS法中5種重金屬元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好(r>0.9993),平均回收率95.6％～108.0％,RSD<10.3％。預(yù)知子藥材與FAE中5種重金屬含量分別為:Pb(2.11±0.09)μg/g,(1.48±0.02)μg/g；As(0.26±0.03)μg/g,(

10、0.22±0.02)μg/g；Cd(0.038±0.001)μg/g,(0.017±0.002)μg/g；Hg(0.037±0.010)μg/g,(0.026±0.007)μg/g,Cu(14.46±0.50)μg/g,(14.45±0.29)μg/g。結(jié)果表明預(yù)知子藥材及FAE中5種有害重金屬元素的含量均低于《中國(guó)藥典》2010版的限量標(biāo)準(zhǔn)。(4)首次建立了檢測(cè)血漿和腦脊液的中常春藤皂苷元的UFLC-MS-MS法,常春藤皂苷元在0.4

11、06-200 ng/mL范圍內(nèi):血漿中:y=0.0245x+0.00671,r=0.9981,腦脊液中:y=0.0520x+0.0529,r=0.9960.日間差2.4％～8.9％,日內(nèi)差1.1％～13.0％,準(zhǔn)確度在-9.0％～11.1％之間。常春藤皂苷元在血漿及腦脊液中的回收率均大于85％,且血漿及腦脊液中內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾,基質(zhì)無(wú)顯著影響。常春藤皂苷元在血漿及腦脊液中凍融(n=3)、長(zhǎng)期(-20℃,7d)、短期和樣品處理后(25℃,

12、4h)穩(wěn)定性良好。表明方法的有效性符合美國(guó)食品藥品管理局對(duì)生物樣品的分析檢測(cè)要求。藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示,大鼠灌胃單次給藥100 mg/kg、400 mg/kg FAE:Cmax分別為11.21±0.50 ng/mL,47.73±1.39ng/mL；Tmax分別為20 min,18.33±2.58 min。血藥濃度消除半衰期t1/2為49.90±1.85 min,44.06±2.98 min。而AUC0-t分別為668.44±20.21

13、 ng/mL*min,3066.46±243.07 ng/mL*min,AUC0-∞為701.42±28.62 ng/mL*min,3131.47±236.83ng/mL*min。消除速率Ke為0.014±0.001和0.016±0.001。在單次給藥(400 mg/kgFAE)20 min時(shí),腦脊液中常春藤皂苷元含量6.17±0.22 ng/mL(RSD,3.5％),表明常春藤皂苷元能穿透血腦屏障。(5)①細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,常春藤皂苷元對(duì)照

14、品和FAE可顯著對(duì)抗Cor造成的PC12細(xì)胞損傷,模型組細(xì)胞A值為0.686±0.058,與溶劑對(duì)照組(0.983±0.054)相比較顯著降低,但經(jīng)常春藤皂苷元(1,5,10μg/mL)和FAE(20μg/mL)(0.780±0.018、0.874±0.030、0.942±0.021；0.957±0.039)或5.0μg/ml ESC(0.956±0.036)預(yù)處理過(guò)的細(xì)胞,其A值較之于模型組細(xì)胞具有顯著升高(P=0.000)。常春藤皂

15、苷元和FAE可顯著對(duì)抗Cor所致的細(xì)胞氧化損傷。②常春藤皂苷元連續(xù)7天重復(fù)給藥后,在FST中與溶劑對(duì)照組(198.4±43.96s)比較,給予劑量為10 mg/kg、50 mg/kg常春藤皂苷元,100 mg/kg FAE或ESC陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間分別為115.9±30.49、110.1±26.49、97.4±22.24、100.25±20.63s,不動(dòng)時(shí)間顯著減少；TST中各實(shí)驗(yàn)組組間差異顯著(P=0.000),不同給藥劑量

16、10mg/kg(197.89±30.65 s)、50 mg/kg(128.38±36.49 s)常春藤皂苷元,100 mg/kg(119.67±23.64 s)FAE以及ESC陽(yáng)性對(duì)照組(109.89±22.75s)小鼠,與溶劑對(duì)照組(228.13±40.34 s)相比,均顯著縮短了空中不動(dòng)時(shí)間;小鼠自主活動(dòng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,常春藤皂苷元和FAE給藥組及ESC組小鼠與溶劑對(duì)照組相比較,水平活動(dòng)計(jì)數(shù)值均無(wú)顯著性差異(P=0.799)。
　

17、　 結(jié)論:FAE中常春藤皂苷元含量達(dá)68％,有機(jī)溶劑殘留量及重金屬檢測(cè),符合《中國(guó)藥典》2010版的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),能夠滿(mǎn)足二類(lèi)中藥新藥的要求。檢測(cè)血漿及腦脊液中常春藤皂苷元的UFLC-MS/MS法,具有高靈敏度,高選擇性,可有效用于藥代動(dòng)力學(xué)的研究,藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示,常春藤皂苷元可經(jīng)腸胃快速吸收分布到血液及腦脊液中,表明常春藤皂苷元能穿透血腦屏障。常春藤皂苷元和FAE均對(duì)Cor誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型具有明顯的保護(hù)作用；并可顯著改善行