預知子提取物活性成分常春藤皂苷元的抗抑郁藥理作用機制研究.pdf

1、目的:抑郁癥是一種常見的精神疾病，表現(xiàn)為一種持久的抑郁狀態(tài)，并伴有意志消沉、思維遲鈍、言語減少、睡眠障礙和自殺傾向等癥狀。抑郁癥迄今已成為全球性的主要精神衛(wèi)生問題，終身患病率達15～17％。目前的抗抑郁藥物主要是合成藥，常用的傳統(tǒng)抗抑郁藥物有單胺氧化酶抑制劑(MAOI)、選擇性5-HT再攝取抑制劑（SSRIs）、選擇性NA再攝取抑制劑(SNRIs)和三環(huán)類抗抑郁劑(TCA)。當前大部分抗抑郁藥物只能緩解部分癥狀，副作用較多且伴隨起效延遲

2、的特點。越來越多的科研工作者將眼光投向開發(fā)新型、高效、低毒副作用的天然抗抑郁藥物。近年來，對中藥小補心湯黃酮類提取物、檳榔堅果、半夏厚樸湯、預知子提取物（Fructus Akebiae extract，F(xiàn)AE）等研究發(fā)現(xiàn)天然藥物具有一定的抗抑郁作用?！侗静菥V目》記載預知子是治療心理疾病、認知行為缺陷，包括失眠、失憶、語言錯亂、恐怖、抑郁等復雜癥候的主要處方成分。此外，有文獻報道FAE具有抗抑郁活性，其主要成分是常春藤皂苷元（Hedera

3、genin，HG）。我們實驗室前期的研究已經(jīng)證實了FAE具有抗抑郁作用，與其增強5-HT、DA神經(jīng)系統(tǒng)作用有關，其中FAE的主要成分HG純度大約70％。在已有研究證實FAE具有抗抑郁作用的基礎上，本課題通過建立細胞和多種動物抑郁模型，對FAE主要成分HG的抗抑郁藥效進行分析評價，并且進一步在出生8～21 d的大鼠中注射氯丙咪嗪（Clomipramine，CL）作為內源性抑郁模型，利用大鼠慢性溫和性不可預知應激（Chronic Unpre

4、dictable Mild Stress，CUMS）作為外源性抑郁模型的基礎上，采用免疫組化(Immunohistochemical，IHC)測定CL模型各組大鼠海馬BDNF表達變化，運用高效液相-電化學方法（HPLC-ECD）測定HG對CUMS大鼠海馬、皮層區(qū)域單胺類神經(jīng)遞質的變化以及實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測HG對CUMS大鼠海馬、皮層BDNF、5-HT1A、5-HTT mRNA的影響以初步明確HG可能的藥

5、理作用機制，為開發(fā)新型、高效、低毒副作用的天然抗抑郁藥物奠定理論基礎和提供實驗依據(jù)。
　　 方法:連續(xù)灌胃給藥14d后進行高架十字迷宮(Elevated plus maze，EPM)以及21d后進行懸尾實驗(Tail suspension test，TST)和強迫游泳實驗(Forcedswimming test，F(xiàn)ST)比較FAE(50 mg·kg-1)和HG(20 mg·kg-1)的抗抑郁活性以初步確定是否是HG發(fā)揮主要的抗抑

6、郁作用。在此基礎上，體外培養(yǎng)PC12細胞，以皮質酮(Cort)誘導PC12細胞損傷建立細胞模型后進行四甲基偶氮唑藍（Methyl Thiazollyl Tetrazolium，MTT）法觀察不同濃度HG（4、8、16μmol·L-1）對PC12細胞活力和形態(tài)的影響;另外，體內單次給藥以及連續(xù)給藥14d后，分別通過TST和FST對不同劑量HG(10、20、40 mg·kg-1)進行抗抑郁活性的藥效學初篩，并考察HG是否影響小鼠的自主活動;

7、試劑盒測定HG對小鼠海馬超氧化物岐化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影響;進一步建立內源性新生大鼠抑郁模型和外源性CUMS抑郁模型。依據(jù)行為學結果評價兩種抑郁模型，抑郁模型成功建立后分為正常對照組(Veh)、模型組(CUMS+Veh或CL+Veh)、陽性對照組(ESC，5 mg·kg-1)和HG處理組(5 mg·kg-1)并連續(xù)灌胃給藥28 d，分別進行曠場實驗(Open field test，OFT)、EPM和FST評價HG對

8、內-外源性大鼠抑郁模型的抗抑郁效果。IHC檢測HG對CL模型大鼠海馬BDNF表達的影響;此外，運用HPLC-ECD測定HG對CUMS模型大鼠的海馬、皮層區(qū)域單胺類神經(jīng)遞質(NA，5-HT)的變化以及RT-PCR檢測BDNF、5-HT1A、5-HTT mRNA的表達情況。
　　 結果:1、利用小鼠行為絕望模型比較FAE和HG的抗抑郁活性
　　 在行為學EPM、TST和FST測試中發(fā)現(xiàn)，分別給予50 mg·kg-1 FAE和

9、20mg·kg-1 HG后，在第14天的EPM中，與Veh組相比，F(xiàn)AE和HG并沒有顯著增加開臂滯留時間百分比；而在給藥21 d后的TST和FST中，與Veh組相比，HG能顯著降低小鼠懸尾和強迫游泳的不動時間，F(xiàn)AE則無顯著變化，不具有統(tǒng)計學差異。
　　 2、HG抗抑郁作用藥效的初步確定
　　 采用Cort誘導PC12細胞損傷建立細胞模型，MTT實驗結果顯示:Cort損傷后細胞活力顯著下降，HG處理組（4、8tmol·L

10、-1）能顯著提高細胞活力，而HG在16μmol·L-1沒有顯著改善細胞的受損程度。在倒置顯微鏡下可觀察到正常的PC12細胞貼壁生長，呈梭形或纖維狀，形態(tài)清晰，結構完整。經(jīng)Cort損傷后，細胞皺縮呈圓形，處于懸浮狀態(tài)，細胞碎片較多。ESC、HG4和8μmol·L-1給藥處理的PC12細胞損傷程度較輕，形態(tài)清晰，結構完整，貼壁生長的細胞明顯增多。而HG16μmol·L-1在一定程度上改善細胞的受損程度，細胞碎片較少。
　　 小鼠TS

11、T和FST結果顯示:急性單次給藥后，與Veh組相比，HG低劑量(10 mg·kg-1)明顯縮短小鼠懸尾不動時間。連續(xù)灌胃給藥14d后，TST和FST結果顯示:與Veh組相比，HG在不影響小鼠自主活動能力的前提下降低小鼠懸尾和強迫游泳的不動時間，其中低劑量具有顯著性差異。試劑盒檢測結果顯示:與Veh組相比，HG能提高小鼠海馬中的SOD活性，并顯著降低MDA含量。
　　 3、內源性CL大鼠抑郁模型實驗
　　 HG對CL大鼠體

12、重變化的影響采用重復測量設計資料的方差分析法進行統(tǒng)計分析，各組大鼠斷奶后每周稱重，給藥前各組體重呈逐步增加的趨勢;給藥后，Veh組、5mg·kg-1CL+ESC組和5 mg·kg-1 CL+HG組均比CL+Veh組表現(xiàn)出相對較高的體重增加，但各組之間無顯著性差異。給藥治療28 d后，OFT結果顯示:與Veh組相比，CL+Veh組水平得分具有降低的趨勢，而ESC和HG具有提高水平得分低的趨勢;各組在垂直得分水平上均無明顯變化，不具有統(tǒng)計學

13、差異。在EPM中，與Veh組比較，CL+Veh大鼠進入開臂滯留時間百分比顯著降低，給予ESC和HG治療后具有升高開臂滯留時間百分比的趨勢，但沒有顯著性差異。在FST中，與Veh組比較，CL+Veh組大鼠的不動時間顯著升高，而給予HG治療后能顯著降低大鼠的不動時間。
　　 此外，從免疫組化圖像中可觀察到與Veh組相比，CL+Veh模型組海馬BDNF陽性細胞數(shù)量明顯減少;與CL+Veh模型組相比，CL+ESC、CL+HG組海馬BDN

14、F表達陽性細胞數(shù)量明顯增加。
　　 4、外源性CUMS大鼠抑郁模型實驗
　　 HG對CUMS大鼠體重變化的影響采用重復測量設計資料的方差分析法進行統(tǒng)計分析，從實驗開始后每周稱重，第5周開始，與Veh組相比，CUMS+Veh組大鼠體重顯著下降;給藥后，與Veh組比較，CUMS+Veh、CUMS+ESC、CUMS+HG各組體重均下降，有統(tǒng)計學差異。行為學評價造模成功后分組，分別在給藥治療14、28 d后進行OFT，給藥14

15、d的OFT結果顯示:各組在水平和垂直得分沒有明顯差異，慢性給藥28 d后，5 mg·kg-1 HG具有提高水平得分和垂直得分的趨勢。在EPM中，給藥28 d后，與CUMS+Veh組比較，CUMS+HG組大鼠進入開臂滯留時間百分比顯著升高，具有顯著性差異。在FST中，與Veh組比較，CUMS+Veh組大鼠的不動時間顯著升高，而慢性給予ESC和HG能顯著降低大鼠的不動時間，具有統(tǒng)計學差異。
　　 行為學結束后分別對CUMS模型大鼠海

16、馬、皮層區(qū)域單胺類神經(jīng)遞質和BDNF、5-HT1A、5-HTT mRNA的表達情況進行檢測。HPLC-ECD結果顯示:CUMS組海馬去甲腎上腺素(NA)和5-羥色胺(5-HT)水平顯著下降，ESC和HG均能逆轉CUMS造成NA、5-HT水平的降低，顯著升高NA、5-HT水平;而在皮層中，ESC和HG具有顯著升高NA水平，同時升高5-HT水平的趨勢，但沒有統(tǒng)計學差異。RT-PCR結果顯示:與Veh組比較，CUMS+Veh組海馬區(qū)域的BDN

17、FmRNA降低，與CUMS+Veh組比較， CUMS+ESC和CUMS+HG組沒有明顯變化;與Veh組比較，CUMS+Veh組5-HT1A mRNA降低，而HG具有提高5-HT1A mRNA水平的趨勢，但不具有統(tǒng)計學差異;CUMS+Veh組5-HTTmRNA明顯升高，慢性給予ESC和HG能使之逆轉，5-HTT mRNA水平顯著下降。而在皮層中，各組之間的BDNF、5-HT1A、5-HTT mRNA表達均無明顯差異。
　　 結論:

18、從以上結果可推測HG較FAE具有更好的抗抑郁活性，HG在體內和體外抑郁模型中具有抗抑郁活性，其對調節(jié)機體氧化-抗氧化酶活性、降低過氧化損傷，保護海馬免受氧化應激損傷起到一定的改善作用。此外，HG對內-外源性抑郁模型動物的焦慮/抑郁樣行為有一定的改善作用，這可能是通過調節(jié)5-HT神經(jīng)系統(tǒng)，升高NA、5-HT水平，顯著降低5-HTT mRNA水平發(fā)揮抗抑郁作用。
　　 綜上所述，本課題證明了FAE的主要成分HG具有良好的抗抑郁藥效作