桂枝湯及其體外消化道模擬產(chǎn)物的藥效學(xué)研究.pdf

1、針對(duì)中藥制劑工藝落后、粗放,無(wú)法進(jìn)行定量控制并制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn),因而成為影響中藥制劑療效穩(wěn)定性等現(xiàn)狀,從中醫(yī)辨證論治的整體效應(yīng)出發(fā),在前期工作中,根據(jù)中藥傳統(tǒng)服藥方式,綜合采用酶解、微生物轉(zhuǎn)化和膜濾技術(shù),成功建立了標(biāo)準(zhǔn)化中藥湯劑整體效應(yīng)分子組的生物模擬集成技術(shù)。并應(yīng)用該技術(shù)對(duì)作用機(jī)制較明確的復(fù)方中藥桂枝湯進(jìn)行了分離純化試驗(yàn),結(jié)果提示,桂枝湯生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物成分與口服桂枝湯湯劑后大鼠門靜脈血中成分基本一致。本課題針對(duì)上述技術(shù),采用酶聯(lián)免疫吸

2、附法(ELISA)和免疫印記法(Westernblot),觀察桂枝湯及其生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物對(duì)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)刺激的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3株)p38MAPK,cPLA2,sPLA2,COX-2,PGES,15-PGDH,NF-κB以及PGE2分泌及表達(dá)的影響。研究桂枝湯及其生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物對(duì)IL-1β刺激的bEnd.3細(xì)胞PGE2代謝通路的影響。希望能為該技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為進(jìn)一步探索中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了新的方法學(xué)

3、啟示,也為中藥復(fù)方劑型改進(jìn)、發(fā)現(xiàn)及創(chuàng)制新型中藥提供實(shí)驗(yàn)支持。
　　 1桂枝湯、桂枝湯體外生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物及其含藥血清的制備
　　 以常規(guī)方法制備桂枝湯。桂枝湯體外生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物(以下簡(jiǎn)稱模擬藥)制備:20mL,桂枝湯湯劑(1.0g飲片／mL)加入100mL蛋白質(zhì)濃度為1300mg·L-1的菌酶溶液(pH7.5)中,充氮,42℃培養(yǎng)36h,反應(yīng)完成后7000r·min-1離心15min。取上清液,以膜孔徑50萬(wàn)道爾頓的超

4、濾柱純化,收集超濾液,減壓濃縮至1.0g飲片／mL。發(fā)現(xiàn)腸內(nèi)菌酶對(duì)桂枝湯的轉(zhuǎn)化作用與消化道對(duì)桂枝湯的消化作用相類似。采用常規(guī)方法制備二者含藥血清。所得產(chǎn)物用于下一步藥效學(xué)研究。
　　 2桂枝湯對(duì)發(fā)熱大鼠的解熱作用
　　 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),酵母可使大鼠體溫明顯升高。桂枝湯大、小劑量組均可使大鼠體溫明顯下調(diào),桂枝湯小劑量組在給藥后2h及3h,桂枝湯大劑量組在給藥后1h及2h產(chǎn)生效應(yīng)。阿司匹林組在給藥后1h,2h及3h均可顯著抑制大

5、鼠體溫上升。酵母造模.3.5h后,大鼠血清IL-1β,PGE2含量明顯上升,桂枝湯大、小劑量組及阿司匹林組均可明顯下調(diào)大鼠血清IL-1β,PGE2含量。實(shí)驗(yàn)證明桂枝湯具有解熱作用,可能與調(diào)節(jié)血清IL-1β,PGE2含量有關(guān)。
　　 3藥物對(duì)IL-1β刺激的bEnd.3細(xì)胞p-p38MAPK表達(dá)的影響
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,IL-1β作用于bEnd.310h后,細(xì)胞p38MAPK表達(dá)無(wú)明顯變化,桂枝湯含藥血清、模擬藥、模擬藥

6、含藥血清各濃度組對(duì)p38MAPK表達(dá)也無(wú)明顯影響；而p-p38MAPK蛋白在IL-1β作用下表達(dá)顯著增加,桂枝湯含藥血清、模擬藥、模擬藥含藥血清各濃度組均可降低IL-1β誘導(dǎo)的p-p38MAPK蛋白的表達(dá),桂枝湯含藥血清及模擬藥含藥血清作用呈現(xiàn)量效關(guān)系。
　　 4藥物對(duì)IL-1β刺激的bEnd.3細(xì)胞PLA2分泌及表達(dá)的影響
　　 ELISA結(jié)果提示,IL-1β作用于細(xì)胞10h后,細(xì)胞外液cPLA2及sPLA2含量均顯著

7、升高,除桂枝湯含藥血清2.5％組對(duì)cPLA2、模擬藥含藥血清2.5％組對(duì)cPLA2及sPLA2未見(jiàn)明顯作用外,桂枝湯含藥血清、模擬藥及模擬藥含藥血清各濃度組均可顯著降低細(xì)胞外液cPLA2及sPLA2含量,且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴。藥效曲線比較發(fā)現(xiàn),在對(duì)cPLA2作用上,桂枝湯含藥血清及模擬藥基本相當(dāng),略好于模擬藥含藥血清。而在對(duì)sPLA2作用上,藥物不同處理后作用基本相當(dāng)。根據(jù)課題組以往對(duì)含藥血清在體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中用量的研究結(jié)果計(jì)算含藥血清的

8、劑量,以g飲片／kg體重／U表示。g飲片／kg體重,即動(dòng)物口飼給藥劑量；U,系含藥血清在體外系統(tǒng)中的稀釋倍數(shù)；g飲片／kg體重／U,即動(dòng)物口飼給藥劑量除以含藥血清在體外系統(tǒng)中的稀釋倍數(shù)。
　　 按上述公式計(jì)算,結(jié)果顯示,桂枝湯含藥血清、模擬藥含藥血清抑制細(xì)胞外液cPLA2含量的IC50分別為10.199,11.468g飲片／kg體重／U,模擬藥抑制細(xì)胞外液cPLA2含量的IC50為52g／L。桂枝湯含藥血清、模擬藥含藥血清抑制細(xì)

9、胞外液sPLA2含量的IC50分別為6.909,7.379g飲片／kg體重／U,模擬藥抑制細(xì)胞外液sPLA2含量的IC50為44g／L。
　　 Westernblot檢測(cè)顯示,IL-1β作用于細(xì)胞10h后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞cPLA2蛋白表達(dá)顯著增加,桂枝湯含藥血清組、模擬藥組、模擬藥含藥血清組均可降低IL-1β誘導(dǎo)的cPLA2蛋白的表達(dá)。
　　 5藥物對(duì)IL-1β刺激的bEnd.3細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響
　　

10、 Westernblot檢測(cè)顯示,IL-1β作用于細(xì)胞10h后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)顯著增加,桂枝湯含藥血清、模擬藥、模擬藥含藥血清均可抑制IL-1β刺激的bEnd.3細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)。其中,桂枝湯含藥血清組隨著藥物濃度增大,效果更加明顯,20％組效果最顯著；模擬藥1％濃度組作用不顯著,2％,4％濃度組作用逐漸增強(qiáng)。模擬藥含藥血清5％,10％濃度組作用不顯著,20％濃度組效果最顯著。
　　 6藥物對(duì)IL-1

11、β刺激的bEnd.3細(xì)胞PGES胞外濃度及表達(dá)的影響
　　 ELISA結(jié)果顯示,IL-1β作用于細(xì)胞10h后,細(xì)胞外液PGES含量顯著升高。桂枝湯含藥血清、模擬藥、模擬藥含藥血清均可抑制IL-1β刺激的bEnd.3細(xì)胞PGES的外漏,且均呈現(xiàn)較明顯的濃度依賴趨勢(shì)。其中,除桂枝湯含藥血清及模擬藥含藥血清2.5％濃度組、模擬藥1％濃度組作用不明顯外,其它各組均呈現(xiàn)顯著性差異。經(jīng)計(jì)算,桂枝湯含藥血清、模擬藥含藥血清抑制細(xì)胞外液PGES

12、含量的IC50分別為10.575,13.207g飲片／kg體重／U,模擬藥抑制細(xì)胞外液PGES含量的IC50為40g／L。
　　 Westernblot檢測(cè)顯示,IL-1β作用于細(xì)胞10h后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞PGES蛋白表達(dá)顯著增加,桂枝湯含藥血清10％,20％濃度組均可明顯降低IL-1β誘導(dǎo)的PGES蛋白的表達(dá)。模擬藥各濃度組對(duì)PGES蛋白的表達(dá)未見(jiàn)明顯影響。模擬藥含藥血清也能降低PGES蛋白的表達(dá),10％濃度組效果最顯著。

13、
　　 7藥物對(duì)IL-1β刺激的bEnd.3細(xì)胞15-PGDH胞內(nèi)外表達(dá)的影響
　　 IL-1β作用于細(xì)胞10h后,細(xì)胞外液15-PGDH含量顯著升高。桂枝湯含藥血清、模擬藥及模擬藥含藥血清各濃度組均可顯著降低IL-1β誘導(dǎo)的bEnd.3細(xì)胞外液15-PGDH的表達(dá),且呈現(xiàn)量效關(guān)系。經(jīng)計(jì)算,桂枝湯含藥血清、模擬藥含藥血清抑制細(xì)胞外液15-PGDH含量的IC50分別為8.554,10.434g飲片／kg體重／U,模擬藥抑制

14、細(xì)胞外液15-PGDH含量的IC50為45g／L。
　　 Westernblot檢測(cè)顯示,IL-1β作用于細(xì)胞10h后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞15-PGDH蛋白表達(dá)顯著增加,桂枝湯含藥血清5％,10％,20％濃度組均可顯著降低IL-1β誘導(dǎo)的15-PGDH蛋白的表達(dá),5％,10％組差別不大,20％組效果最顯著。模擬藥1％,2％濃度組對(duì)IL-1β刺激的15-PGDH蛋白的表達(dá)未見(jiàn)明顯影響,4％濃度組可顯著降低15-PGDH蛋白的表達(dá)。

15、模擬藥含藥血清5％,10％,20％濃度組均可顯著降低IL-1β誘導(dǎo)的15-PGDH蛋白的表達(dá),隨藥物濃度升高,作用更加明顯。
　　 8藥物對(duì)IL-1β刺激的bEnd.3細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響
　　 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IL-1β對(duì)bEnd.3細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響,可使p-NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加,桂枝湯含藥血清、模擬藥、模擬藥含藥血清低濃度組對(duì)p-NF-κB的作用均不明顯,高濃度組可顯著降低p-NF-κB蛋白的表達(dá)

16、。
　　 9藥物對(duì)IL-1β刺激的bEnd.3細(xì)胞PGE2分泌的影響
　　 IL-1β作用于細(xì)胞10h后,細(xì)胞外液PGE2含量顯著升高。桂枝湯含藥血清、模擬藥物及模擬藥含藥血清均可顯著降低IL-1β誘導(dǎo)的PGE2的表達(dá),且呈現(xiàn)量效關(guān)系。藥效曲線比較發(fā)現(xiàn),在低濃度區(qū)域,模擬藥效果較好,到高濃度處與桂枝湯含藥血清重合,但均強(qiáng)于模擬藥含藥血清。經(jīng)計(jì)算,桂枝湯含藥血清、模擬藥含藥血清抑制細(xì)胞外液PGE2含量的IC50分別為8.6

17、01、10.528g飲片／kg體重／U,模擬藥抑制細(xì)胞外液PGE2含量的IC50為56g／L。
　　 綜上所述,桂枝湯可顯著降低酵母誘導(dǎo)的大鼠體溫升高,其機(jī)制可能與降低大鼠血清IL-1β,PGE2的含量有關(guān)。桂枝湯含藥血清及生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物含藥血清可降低IL-1β刺激的bEnd.3細(xì)胞p-p38MAPK,cPLA2,sPLA2,COX-2,PGES,15-PGDH,p-NF-κB以及PGE2的分泌及表達(dá),桂枝湯生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物除

18、對(duì)PGES蛋白表達(dá)作用不明顯外,對(duì)其它指標(biāo)均產(chǎn)生顯著影響。桂枝湯生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物抑制細(xì)胞外液15-PGDH,PGE2,PGES,sPLA2,cPLA2含量的IC50分別為45,56,40,44,52g／L,提示桂枝湯生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物對(duì)各指標(biāo)作用由強(qiáng)到弱順序?yàn)镻GES>sPLA2>15-PGDH>cPLA2>PGE2。桂枝湯含藥血清各項(xiàng)IC50分別為8.554,8.601,10.575,6.909,10.099g飲片／kg體重／U,作用由

19、強(qiáng)到弱順序?yàn)閟PLA2>15-PGDH>PGE2>cPLA2>PGES。生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物含藥血清各項(xiàng)IC50分別為10.434,10.528,13.207,7.379,11.468g飲片／kg體重／U,作用由強(qiáng)到弱順序?yàn)閟PLA2>15-PGDH>PGE2>cPLA2>PGES。結(jié)果顯示,桂枝湯生物轉(zhuǎn)化模擬及其含藥血清具有與原方相似的藥效。這為進(jìn)一步探索中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了新的方法學(xué)啟示,也為中藥復(fù)方劑型改進(jìn)、發(fā)現(xiàn)及創(chuàng)制新型中藥提供實(shí)