半胱氨酸殘基對(duì)黃曲霉尿酸氧化酶功能的意義.pdf

1、尿酸氧化酶(urate oxidase，UOX EC1.7.3.3)是生物體內(nèi)嘌呤代謝過程中的關(guān)鍵酶，能夠催化尿酸轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚰宜?。除人類和一些高等靈長目動(dòng)物外，絕大多數(shù)生物體內(nèi)能產(chǎn)生具有生物活性的尿酸氧化酶。這可能是因?yàn)檫M(jìn)化而產(chǎn)生的優(yōu)勢，因?yàn)槟蛩崾菑?qiáng)有力的氧自由基去除劑，所以人體內(nèi)氧自由基的含量很低，因而因?yàn)樗ダ隙a(chǎn)生癌癥的幾率大大下降。但由于先天或后天的原因引起的尿酸在體內(nèi)生成增加或排泄障礙，就會(huì)導(dǎo)致高尿酸血癥，從而引起各種相關(guān)的疾病，

2、如痛風(fēng)、腎結(jié)石等。此外，細(xì)胞的快速的裂解會(huì)引發(fā)以高尿酸血癥為主要臨床體征的腫瘤溶解綜合癥(tumor lysis syndrome，TLS)。利用UOX治療TLS是國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，同時(shí)逐漸成為治療難治性痛風(fēng)等高尿酸相關(guān)疾病的潛在治療方法。
　　 黃曲霉尿酸氧化酶(Aspergillus flavus urate oxidase；A.flavus UOX)是T-折疊家族蛋白質(zhì)中的一員，該家族的蛋白質(zhì)雖然序列一致性很低，但其結(jié)構(gòu)

3、卻又很大的相似性，它們均表現(xiàn)出相似的寡聚化模式。X-ray衍射分析表明有生物活性的A.flavs UOX是由四個(gè)單體亞基(每個(gè)亞基含301個(gè)氨基酸，大小約34kDa)構(gòu)成的同四聚體(135kDa)，呈中空的隧道形。A.flavus UOX的氨基酸序列中含有三個(gè)半胱氨酸Cys35，Cys103，Cys290。通過與其他來源的UOX進(jìn)行序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，三個(gè)半胱氨酸均非保守半胱氨酸，且不形成亞基內(nèi)部和亞基之間的二硫鍵。但是有研究表明，三個(gè)半胱氨

4、酸均有可能因?yàn)槠淞蛟拥娜∠?、被氧化或被連接一個(gè)加合物而影響尿酸氧化酶的活性。
　　 為分析半胱氨酸殘基對(duì)該酶的生物學(xué)活性的作用，選擇利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)突變體C35A，C103A，C290A，C35A/C103A，C35A/C290A，C103A/C290A，C35A/C103A/C290A，將相應(yīng)位點(diǎn)的半胱氨酸突變?yōu)楸彼?。首先采用融合PCR的方法，構(gòu)建了突變體的基因，將PCR產(chǎn)物克隆到T載體上進(jìn)行核苷酸序列分析，通過 Ve

5、ctor NTI與原始序列進(jìn)行比對(duì)，確定獲得了預(yù)期的突變體基因。將突變體基因進(jìn)行雙酶切后回收，亞克隆到表達(dá)載體pET-42a(+)的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，構(gòu)建突變體的相應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒。表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，符合預(yù)期后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，經(jīng)過氨芐青霉素篩選，即獲得表達(dá)突變體的菌株。隨機(jī)挑取突變體的菌株接種到LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待菌密度OD600達(dá)到大約1.0時(shí)，加入終濃度為0.6mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，37℃誘導(dǎo)5小時(shí)。取誘導(dǎo)

6、后菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，突變體蛋白均獲得高效可溶性表達(dá)，大小約34kDa，符合預(yù)期，目的蛋白占蛋白總量的30％-55％。
　　 根據(jù)前期的研究基礎(chǔ)和突變體蛋白的性質(zhì)，設(shè)計(jì)并優(yōu)化了純化工藝。首先采用phenyl sephrose FF疏水柱，捕獲目的蛋白；接著采用DEAE陰離子柱純化進(jìn)行精細(xì)純化，去除雜蛋白，大大降低內(nèi)素素，蛋白純度>90％；最后采用phenyl sephroseHP進(jìn)行濃縮并進(jìn)一步去除雜蛋白，獲

7、得純度大于95％的突變體。
　　 獲得純化的蛋白后，對(duì)其進(jìn)行各種理化性質(zhì)分析。SDS-PAGE顯示與國外上市的同類制品具有一致的電泳結(jié)果。制備國外上市制品Rasburicase的兔多抗，并進(jìn)行WB檢測，顯示突變體能夠與兔多抗特異結(jié)合。在非還原狀態(tài)下進(jìn)行SDS-PAGE分析時(shí)，經(jīng)由二硫鍵連接形成的異二聚體的量占蛋白總量的比例為0％-29％，經(jīng)分析證明，Cys290對(duì)二聚體形成起的作用最大，Cys35最小。但HPLC結(jié)果顯示，各突變

8、體與原型均與國外上市標(biāo)準(zhǔn)品具有一致的保留時(shí)間，提示純化后的產(chǎn)品以四聚體存在，而無可檢測得到的二聚體存在。造成這種差異的原因?yàn)檫M(jìn)行SDS-PAGE時(shí)，四聚體在SDS的作用下解聚，各亞基多肽鏈伸展后造成其中的Cys不同程度的暴露，而后在加熱的作用下，互相靠近的不同亞基因其半胱氨酸被氧化形成二硫鍵而連接形成二聚體。這種現(xiàn)象提示我們?cè)谶M(jìn)行多亞基蛋白和含Cys的蛋白的研究和相關(guān)藥物報(bào)批時(shí)，不能單獨(dú)以SDS-PAGE結(jié)果作為其純度等指標(biāo)的檢測手段。

9、
　　 體外活性方面，在還原條件下，各突變體活性為原型的41.8％-134.1％，其中C103A最高(134.1％)，C35A/C103A/C290A最低(41.8％)，造成這一現(xiàn)象的原因猜測為不同位點(diǎn)的Cys的存在對(duì)維系四級(jí)結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)的構(gòu)象起到不同的作用；與氧化條件下相比，各突變體及原型在還原條件下活性均有不同的變化，增加最多的為C290A(增加約64.4％)，降低最多的為C35A/C103A/C290A(降低15.5％)

10、，分析其原因?yàn)檫€原條件下，原型及突變體中氧化的Cys被還原，其上附著的加合物被去除的原因；最接近實(shí)際生產(chǎn)條件的氧化條件下，影響突變體活性的因素可視為以上兩種情況的疊加，其中C103A活性增加最多(增加56.1％)，C35A/C103A/C290A減少最多(減少27.1％)。綜合分析，各個(gè)Cys雖然會(huì)因被氧化而影響酶的活性，但是對(duì)酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和活性位點(diǎn)構(gòu)象的維系可能會(huì)起到間接的作用。三個(gè)位點(diǎn)對(duì)活性的影響是累加的、復(fù)合的作用。將三個(gè)位