低頻短時電刺激對周圍運動神經(jīng)再生選擇性的影響和作用機制.pdf

1、目的：研究周圍神經(jīng)損傷后，在失去靶器官聯(lián)系的條件下，短時、低頻電刺激對運動神經(jīng)再生選擇性的影響并探討其可能的作用機制。
　　 方法：本實驗采用SD大鼠股神經(jīng)作為研究模型。在股神經(jīng)終末分支處近段造成神經(jīng)離斷傷，使用PGA(Polyglycolic Acid)神經(jīng)導管修復后進行電刺激。神經(jīng)修復8周后通過熒光示蹤劑自股神經(jīng)終末感覺和運動分支處進行逆向示蹤，檢測電刺激對運動神經(jīng)再生選擇性的影響。隨后再采用周圍神經(jīng)損傷模型，于神經(jīng)損傷修復

2、后3周（再生選擇性開始的時間）通過實時定量PCR(Real-time PCR)及ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)方法檢測神經(jīng)再生路徑及靶器官中各種營養(yǎng)因子的蛋白及核酸水平。最后，通過神經(jīng)元原代培養(yǎng)、熒光免疫組化、Western Blot，激光掃描共聚焦(Laser ScanningConfocal)等方法研究與電刺激引發(fā)神經(jīng)元興奮性變化有密切關(guān)系的細胞內(nèi)Ca2+以及對細胞生命活動具有重要作

3、用的MAPK信號通路分子Erk與神經(jīng)營養(yǎng)因子表達之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 ①．股神經(jīng)損傷后，63.47±2.29％的運動神經(jīng)重新回到運動路徑中來。失去靶器官聯(lián)系后正確投射的運動神經(jīng)比例下降到32.83±1.91%(P＜0.05)，再生神經(jīng)數(shù)量也下降(P＜0.05)。提示靶器官源性信號不僅對運動神經(jīng)的再生具有導向作用，也是神經(jīng)成功再生所不可缺少的。給予低頻電刺激后運動神經(jīng)再生的選擇性明顯改善，86.84±5.64%

4、的運動神經(jīng)正確投射到原來的運動路徑中來。即使在失去靶器官聯(lián)系后也有82.26±1.37%的運動神經(jīng)進行了正確的路徑選擇。盡管電刺激具有對運動神經(jīng)再生選擇性的促進作用，但是并不能改善再生神經(jīng)相關(guān)運動神經(jīng)元的數(shù)量。
　　 ②．ELISA結(jié)果提示，周圍神經(jīng)損傷后3周，遠段神經(jīng)及腓腸肌中各類營養(yǎng)因子(BDNF、GDNF、NT-3、NT-4)蛋白水平較正常對照組升高(P＜0.05)。失去靶器官聯(lián)系后遠端路徑中BDNF，GDNF以及NT-3

5、的蛋白水平較正常對照組升高，但其升高幅度較保留靶器官聯(lián)系組顯著降低(P＜0.05)。無靶器官聯(lián)系組BDNF及GDNF蛋白水平僅為保留靶器官聯(lián)系組含量的一半(P＜0.05)，提示失去靶器官聯(lián)系后，神經(jīng)再生路徑中的營養(yǎng)微環(huán)境惡化。電刺激后，損傷神經(jīng)遠端路徑中神經(jīng)營養(yǎng)因子的水平較單純損傷組顯著升高（除NT-4外）(P＜0.05)，并且不受靶器官聯(lián)系狀態(tài)的影響。與電刺激后遠端路徑中各營養(yǎng)因子的蛋白水平升高不同，營養(yǎng)因子的核酸水平并沒有顯著改變甚

6、至有所降低。
　　 ③．周圍神經(jīng)損傷后，電刺激可使脊髓運動神經(jīng)元BDNF表達顯著升高，并且集中在前角大胞體的運動神經(jīng)元。電刺激后體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元BDNF的表達也顯著升高(P＜0.05)。激光掃描共聚焦方法檢測發(fā)現(xiàn)，電刺激培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元的Ca2+水平進行性升高，更換不含Ca2+的孵育液時消失，并且可以被電壓門控型Ca2+通道阻滯劑尼非地平所減弱。同時，免疫組化及Western blot結(jié)果提示尼非地平還能部分抑制電刺激后脊髓神

7、經(jīng)元BDNF的表達。此外，在體外培養(yǎng)體系中加入Erk的抑制劑后進行電刺激神經(jīng)元BDNF的表達也受到抑制。
　　 結(jié)論：電刺激能夠不依賴于靶器官聯(lián)系的影響而促進運動神經(jīng)的選擇性再生。其機制可能是通過Ca2+-Erk依賴的信號通路促進脊髓神經(jīng)元BDNF的表達，表達升高的營養(yǎng)因子通過軸漿流動運輸?shù)綋p傷位點局部，改善該處的再生營養(yǎng)微環(huán)境，并作用于該處的神經(jīng)膠質(zhì)細胞表達路徑特異性的導向蛋白，促進神經(jīng)的再生和識別正確的路徑信息，從而改善其再