金黃色葡萄球菌激活中性粒細(xì)胞致血管滲漏機(jī)制研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是引起感染的常見的病原菌，特別是社區(qū)相關(guān)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（CA-MRSA）的出現(xiàn)，嚴(yán)重的威脅到人類的健康。CA-MRSA的輕微感染會(huì)引起皮膚或軟組織等定植感染，嚴(yán)重感染可引起比如膿毒癥、中毒性休克綜合征等。一些臨床癥狀顯示，在金葡菌引起的嚴(yán)重感染的前期伴隨有水腫、低血壓，血漿滲漏等現(xiàn)象，疾病后期則會(huì)演變?yōu)樾菘?、多器官衰竭等癥狀，這些現(xiàn)象表明在金葡菌感染的過程中存在重要的病理學(xué)變化-血管內(nèi)皮屏障的損傷。
　　

2、文獻(xiàn)調(diào)研顯示，目前已報(bào)道的金葡菌感染引起內(nèi)皮屏障通透性改變的主要毒力因子有四種：超抗原類蛋白、α-溶血素、殺白細(xì)胞素和半胱氨酸蛋白酶類，通過直接或間接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞影響血管通透性。除此之外，一些臨床上的研究顯示仍有一些未知的作用機(jī)制。
　　在對(duì)膿毒癥的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞（PMN）來源的肝素結(jié)合蛋白（HBP）在細(xì)菌性膿毒癥發(fā)生的過程中可以監(jiān)控病程發(fā)展以及預(yù)后，而且與血管通透性的改變關(guān)系密切。在研究A族鏈球菌引起膿毒癥的致

3、病機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，鏈球菌M蛋白可以與血漿中的纖維蛋白原結(jié)合，然后通過β2整合素受體激活PMN脫顆粒釋放HBP，引起血管滲漏。同樣本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)在豬鏈球菌感染引起的中毒性休克綜合征中，病人血清中的HBP高于正常水平，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)豬溶素Sly是其重要的刺激因子，這些研究基礎(chǔ)為我們尋找金葡菌毒力因子與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的作用的新機(jī)制提供了重要線索。
　　為了研究金葡菌感染與HBP的關(guān)系，我們首先收集了一些金葡菌嚴(yán)重感染、具有膿毒癥、多

4、器官衰竭等臨床癥狀的病人血清以及一些健康人血清，另外還收集了多株臨床分離的CA-MRSA和HA-MRSA菌株，進(jìn)行刺激HBP釋放的評(píng)價(jià)，確定了HBP濃度升高與金葡菌嚴(yán)重感染之間存在顯著相關(guān)性。同時(shí)結(jié)果顯示CA-MRSA的刺激能力比HA-MRSA高，這些為我們進(jìn)一步的研究金葡菌中HBP的刺激源奠定了基礎(chǔ)。
　　隨后，為了確定上清中的刺激源，我們從性質(zhì)入手，用蛋白酶K與熱滅活處理確定了刺激源是耐熱蛋白質(zhì)，通過離子交換柱的分離純化并結(jié)合

5、體外活性檢測(cè)以及高分辨率的SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)高活性組分與低活性組分在約3KD處存在差異條帶，然后用乙醇萃取方法將上清中小分子多肽抽離出，經(jīng)過功能驗(yàn)證后進(jìn)行質(zhì)譜分析，我們共鑒定出了多種活性成分，其中包括3種PSMα（PSMα1，PSMα2，PSMα4）以及δ毒素。
　　結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研，α型 PSM是金葡菌重要的毒力因子，被認(rèn)為是引起CA-MRSA高毒力的原因之一，雖然PSMα1-3對(duì)中性粒細(xì)胞的裂解能力可以達(dá)到80％-90%，但

6、是研究發(fā)現(xiàn)血清中的高密度脂蛋白可以與PSMα結(jié)合導(dǎo)致其功能喪失。隨后有研究報(bào)道PSMα能介導(dǎo)金葡菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)裂解細(xì)胞進(jìn)行逃逸的新功能，這也意味著游離的PSMα1-3在生理?xiàng)l件下可能不能有效的發(fā)揮作用。
　　為了進(jìn)一步研究質(zhì)譜鑒定出的活性成分與HBP的關(guān)系，我們合成了這五種多肽，用模擬人體內(nèi)環(huán)境的全血體系以及離體 PMN加血清的實(shí)驗(yàn)對(duì)它們進(jìn)行HBP釋放功能評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其它三種多肽相比，PSMα4可以擺脫血漿脂蛋白的封閉激活中性

7、粒細(xì)胞釋放HBP，進(jìn)而又通過敲除株、互補(bǔ)株實(shí)驗(yàn)確定PSMα4是金葡菌上清中重要的HBP刺激源，并通過觀察CD63分子的移動(dòng)以及髓過氧化物酶（MPO）和彈性蛋白酶（Elastase）的釋放確定了HBP的釋放是通過PSMα4激活PMN脫顆粒實(shí)現(xiàn)的。
　　在對(duì)受體和信號(hào)通路的研究中，我們發(fā)現(xiàn)甲?；鶎?duì)PSMα4功能發(fā)揮有重要作用，而文獻(xiàn)報(bào)道的PSMα引起的PMN趨化與鈣離子內(nèi)流不需要甲酰基的參與。說明這是FPR2受體介導(dǎo)的兩種不同通路。抑

8、制劑作用發(fā)現(xiàn)PI3K對(duì)HBP釋放起重要作用，與細(xì)胞骨架重排相關(guān)的Rac2分子也可能參與其中。鈣離子螯合劑EGTA以及胞內(nèi)鈣離子探針結(jié)果說明PSMα4引起HBP的釋放與鈣離子內(nèi)流也有緊密的聯(lián)系?？紤]到PSMα4是PSMα四種甲?；闹形ㄒ豢梢源碳BP釋放的，說明除了甲?；膺€有其它的氨基酸位點(diǎn)發(fā)揮作用，我們采用丙氨酸掃描突變法篩選關(guān)鍵位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了一些位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致PSMα4刺激HBP釋放的能力完全喪失；這些位點(diǎn)究竟如何影響PSMα4的功

9、能有待于進(jìn)一步的研究。
　　接著我們通過構(gòu)建單層細(xì)胞Transwell模型以及小鼠皮膚滲漏的Miles assay進(jìn)行PSMα4功能評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSMα4與PMN作用后的上清會(huì)增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，加入HBP抗體后這種影響會(huì)被抑制。同時(shí)也檢測(cè)到了與脫顆粒緊密相關(guān)的呼吸爆發(fā)，這些結(jié)果驗(yàn)證了HBP在PSMα4引起血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變中的重要作用。在小鼠皮膚滲漏實(shí)驗(yàn)中，野生株、敲除株和互補(bǔ)株上清以及合成多肽評(píng)價(jià)證明了PSMα4是引起

10、小鼠皮膚血管滲漏的主要原因，通過抑制劑WRW4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明PSMα4是通過FPR-2受體介導(dǎo)滲漏。為了進(jìn)一步的驗(yàn)證PMN在這個(gè)過程中的重要作用，我們構(gòu)建了中性粒細(xì)胞減少癥（neutropenic）小鼠，野生株培養(yǎng)上清和PSMα4多肽在neutropenic小鼠皮膚造成的滲漏明顯低于野生型小鼠。然后我們將分離得到小鼠 PMN與PSMα4共孵育上清注射進(jìn)入neutropenic小鼠皮膚內(nèi)，與對(duì)照組多肽相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚出現(xiàn)的滲漏更加嚴(yán)重

11、。同時(shí)也檢測(cè)到了可能與HBP同源類似物同儲(chǔ)存于初級(jí)顆粒中的的小鼠髓過氧化物酶（MPO），這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了在小鼠皮膚上引起血管滲漏的是來自于中性粒細(xì)胞的分泌物。
　　最后我們用小鼠感染模型來評(píng)價(jià)PSMα4通過激活中性粒細(xì)胞脫顆粒引起血管滲漏。我們?nèi)⊙軡B漏現(xiàn)象較明顯的肺部進(jìn)行觀察，通過肺部的組織切片HE染色與掃描電鏡的觀察結(jié)果可以看出，感染野生株的小鼠肺組織間隙中有明顯的紅細(xì)胞以及血漿的滲出，而敲除株以及PBS對(duì)照組沒有這種現(xiàn)象