Calpain-2對(duì)阿霉素心肌毒性干預(yù)作用的研究及ragB-mGITRL DNA疫苗的研制.pdf

1、心肌損傷可由病毒、細(xì)菌等感染導(dǎo)致的心肌炎或化學(xué)藥物的毒性作用等多種因素所介導(dǎo)，嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康。本論文涉及對(duì)阿霉素和牙齦卟啉菌兩類(lèi)心臟毒性誘因的干預(yù)性研究，旨在趨利避害，從源頭上預(yù)防兩類(lèi)因素對(duì)心臟造成的病理性損傷。
　　 阿霉素，是一種作用于DNA的蒽環(huán)類(lèi)抗生素，廣泛應(yīng)用于臨床抗腫瘤的藥物。阿霉素的應(yīng)用帶來(lái)多方面的副作用，包括惡心、嘔吐和心律不齊等。其中當(dāng)累積劑量達(dá)到55mg/m2時(shí)，能夠引起充血性心衰、擴(kuò)張性心肌病甚至死亡，

2、從而限制了其臨床應(yīng)用。迄今為止，阿霉素的急性和累積性心臟毒性的機(jī)制尚未完全清楚，更無(wú)預(yù)防和治療阿霉素誘導(dǎo)心肌病行之有效的措施。
　　 Calpain，即鈣蛋白酶，屬于鈣離子依賴(lài)的半胱氨酸蛋白酶家族，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物以及多種其他生物。人類(lèi)已鑒定的15種亞型的分布、結(jié)構(gòu)和功能均有明顯差異。其中μ-calpain(calpain-1)和m-calpain（calpain-2）為普遍存在且研究深入。Calpain的激活參與機(jī)體多系統(tǒng)疾

3、病，如糖尿病、阿爾滋海默氏病、動(dòng)脈粥樣硬化以及胃癌等。前期研究發(fā)現(xiàn)，calpastatin的過(guò)表達(dá)，加劇了阿霉素引起的急性心肌毒性，表明calpain與其密切相關(guān)，calpain-1或calpain-2是否參與了保護(hù)作用？其分子機(jī)制如何？尚待研究證實(shí)。
　　 心血管系統(tǒng)的另一重要疾病動(dòng)脈粥樣硬化，心肌缺血性損傷是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的不良后果，可有多種因素促其發(fā)生，其中，牙周炎就是一重要誘因。牙齦卟啉菌是牙周炎的主要致病菌，同時(shí)牙齦

4、卟啉菌又參與并促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成。鑒于此，研究牙齦卟啉菌疫苗以有效地預(yù)防牙周炎的發(fā)生，減少發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的可能性。GITR-GITRL是新近發(fā)現(xiàn)的免疫應(yīng)答發(fā)生過(guò)程中共刺激分子，若在使用牙齦卟啉菌疫苗時(shí)輔以GITRL，也許能增強(qiáng)抗原刺激作用，更加有效的清除入侵的病原微生物，對(duì)抗感染免疫起著推波助瀾的作用。有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　 目的：
　　 (1)我們前期研究發(fā)現(xiàn)在阿霉素刺激的原代心肌細(xì)胞和腹腔注射阿霉素引起calp

5、astatin過(guò)表達(dá)小鼠急性心肌毒性模型的心臟中，降低了calpain的表達(dá)及其活性;因calpastatin在體內(nèi)的過(guò)表達(dá)，加劇了小鼠的心功能障礙以及死亡率。以上研究表明，內(nèi)源性calpain對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌毒性提供了保護(hù)作用，但哪些亞型的calpain參與保護(hù)作用，不甚清楚。本研究旨在探討calpain-2在阿霉素誘導(dǎo)的心肌毒性中的作用及其可能的分子機(jī)制。
　　 (2)為了進(jìn)一步體內(nèi)研究calpain-2在阿霉素誘導(dǎo)的心肌

6、毒性中的作用，構(gòu)建心肌特異性、可誘導(dǎo)性的calpain-2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。在轉(zhuǎn)基因小鼠的基礎(chǔ)上，應(yīng)用阿霉素誘導(dǎo)小鼠急性和慢性心肌毒性模型，研究calpain-2在此兩種模型中所扮演的角色及其作用機(jī)制。
　　 (3)已有研究表明，牙齦卟啉菌不僅與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化及其誘發(fā)的心肌缺血性損傷有關(guān)，而且其所導(dǎo)致的牙周炎還是眾多疾病的誘因，如吸入性肺炎、慢性腎病、糖尿病等。因此，本課題通過(guò)研究制備牙齦卟啉菌外膜蛋白R(shí)agB的DNA疫苗，并

7、輔以GITRL為佐劑，為預(yù)防牙齦卟啉菌感染性牙周炎，控制動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生與發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。同時(shí)，探討RagB-GITRL DNA疫苗對(duì)牙齦卟啉菌感染的保護(hù)作用及其分子機(jī)制，為DNA疫苗研究提供新的思路。
　　 方法：
　　 (1)心肌特異性和可誘導(dǎo)性calpain-2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的建立PCR法獲得5'端帶有TetO和α-MHC啟動(dòng)子核酸序列和3'端帶有hGH核酸序列的hcalpain-2片段，克隆至真

8、核表達(dá)載體。質(zhì)粒經(jīng)顯微注射技術(shù)導(dǎo)入小鼠受精卵，再將其植入受體小鼠子宮，發(fā)育成hcalpain-2轉(zhuǎn)基因小鼠。選擇hcalpain-2陽(yáng)性的小鼠與tTA轉(zhuǎn)基因小鼠交配，其后代進(jìn)行基因型鑒定，酶譜法檢測(cè)hcalpain-2在心肌中的活性，western blot法評(píng)估hcalpain-2以及calpain-1在轉(zhuǎn)基因小鼠心臟或肺中的表達(dá)，并多普勒法檢測(cè)小鼠的心臟功能。
　　 (2)阿霉素誘導(dǎo)小鼠心肌毒性模型的建立及分析將基因型鑒定后

9、的轉(zhuǎn)基因小鼠分成對(duì)照組和阿霉素處理組，每組中每種基因型小鼠至少四只，且阿霉素處理組中Tg-tTA/capn-2基因型小鼠至少6-8只。阿霉素誘導(dǎo)急性心肌毒性模型:12周齡的雄性四種基因型小鼠，按體重腹腔給予阿霉素;對(duì)照組小鼠腹腔給予無(wú)菌PBS。同時(shí)，另取Tg-capn-2和Tg-tTA/capn-2小鼠各六只，腹腔給予calpain抑制劑(CI-Ⅲ)。阿霉素誘導(dǎo)的慢性心肌毒性模型:8周齡雄性四種基因型小鼠，按體重腹腔給予阿霉素;對(duì)照組小

10、鼠腹腔給予無(wú)菌PBS。將已構(gòu)建好的模型小鼠進(jìn)行心臟超聲檢查心功能的改變，并留取心臟標(biāo)本用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　 (3)評(píng)估calpain-2對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心肌毒性的保護(hù)作用機(jī)制分離新生小鼠心肌細(xì)胞，進(jìn)行以下處理:感染腺病毒Ad-calpain-2和Ad-HA，給予1μM的阿霉素，AMC底物法檢測(cè)心肌細(xì)胞caspase-3活性、ELISA法檢測(cè)DNA片段化水平和western blot法檢測(cè)AKT磷酸化水平;感染腺病毒Ad-calpas

11、tatin和Ad-HA，給予1μM的阿霉素，AMC底物法檢測(cè)心肌細(xì)胞caspase-3活性、ELISA法檢測(cè)DNA片段化水平和western blot法檢測(cè)AKT磷酸化水平。
　　 取出急性心肌毒性模型的小鼠心肌組織，進(jìn)行以下處理:取一片心肌組織，應(yīng)用AMC底物法檢測(cè)caspase-3的活性;另取一片心肌組織，western blot法檢測(cè)AKT的磷酸化水平。包埋阿霉素誘導(dǎo)的慢性心肌毒性模型的心臟組織，應(yīng)用WGA染色法計(jì)量心肌細(xì)

12、胞大小。
　　 (4)牙齦卟啉菌DNA疫苗的構(gòu)建及體外表達(dá)以ragB和mGITRL質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增ragB和mGITRL片段，克隆至載體pIRES。獲得重組子pIRES-ragB和pIRES-ragB-mGITRL，用于后續(xù)試驗(yàn)。將成功構(gòu)建的重組子轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，western blot檢測(cè)ragB和mGITRL在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 (5)外膜蛋白ragB-mGITRL DNA疫苗在預(yù)防牙齦卟啉

13、菌感染中的作用及其分子機(jī)制將構(gòu)建并鑒定的重組子肌肉注射6周齡的雌性Balb/c小鼠，隨機(jī)分成三組，分別注射pIRES-ragB、pIRES-ragB-mGITRL和pIRES。注射六周后，小鼠腹部皮下注射1×109的牙齦卟啉菌誘導(dǎo)潰瘍模型（腹部皮下潰瘍模型代替牙周炎模型），48小時(shí)后，測(cè)量潰瘍面積。ELISA法檢測(cè)血清中抗RagB抗體的滴度;分離脾臟細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，ELISPOT法檢測(cè)脾臟細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中RagB特異性抗原形成細(xì)胞的數(shù)量

14、;QRT-PCR法檢測(cè)脾臟中細(xì)胞因子IL-21和IFN-γ mRNA水平;FCM法檢測(cè)脾臟中Tfh細(xì)胞和IFN-γ+T細(xì)胞的比例。
　　 結(jié)果：
　　 (1) PCR擴(kuò)增出5'端帶入TetO和α-MHC啟動(dòng)子核酸序列和3'端帶入hGH核酸序列的hcalpain-2片段，并構(gòu)建至真核雙表達(dá)載體。構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠受精卵并植入受體小鼠的子宮，發(fā)育成帶有hcalpain-2基因的小鼠。選擇hcalpain-2陽(yáng)性小鼠和tTA轉(zhuǎn)

15、基因小鼠交配獲得四種基因型小鼠，即WT、Tg-capn-2、Tg-tTA和Tg-tTA/capn-2。Western blot證實(shí)hcalpain-2在心臟特異性并可誘導(dǎo)性表達(dá)，而對(duì)其他器官內(nèi)源性calpain-1和calpain-2蛋白水平無(wú)影響。酶譜法結(jié)果顯不，hcalpain-2在心肌中過(guò)表達(dá)提高calpain-2的活性。小鼠心功能檢測(cè)表明，四種基因型小鼠的心臟收縮和舒張功能沒(méi)有差異。
　　 (2)建立阿霉素誘導(dǎo)的急性心肌

16、毒性模型和慢性心肌毒性模型，心臟功能檢測(cè)表明:在急性心肌毒性模型中，阿霉素處理組（WT、Tg-capn-2和Tg-tTA）與Sham組相比，明顯降低心臟的收縮功能，而在calpain-2過(guò)表達(dá)的阿霉素處理組，心臟收縮功能明顯改善，給予calpain抑制劑(CI-Ⅲ)后阻斷了calpain-2過(guò)表達(dá)引起的心臟收縮功能的改善;在慢性心肌毒性模型中，阿霉素處理組(WT、Tg-capn-2和Tg-tTA)與Sham組相比，明顯降低了心臟的收縮和

17、舒張功能，而在calpain-2過(guò)表達(dá)的阿霉素處理組，兩者都顯著改善。
　　 (3)在calpain-2過(guò)表達(dá)的心肌細(xì)胞中:①經(jīng)阿霉素處理后，其caspase-3的活性與對(duì)照組相比顯著降低，DNA片段化也明顯改善，且AKT的磷酸化水平顯著上調(diào)。然而，calpain-1在原代心肌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)升高了細(xì)胞caspase-3活性和增加了DNA片段化。②在calpain藥理性抑制劑CI-Ⅲ、PD150606和生理性?xún)?nèi)源性抑制劑calpa

18、statin的作用下，經(jīng)阿霉素處理后，與未加抑制劑組相比心肌細(xì)胞的caspase-3活性和DNA片段化都明顯增高。③在calpastatin過(guò)表達(dá)的心肌細(xì)胞，經(jīng)阿霉素處理后，與Ad-HA組相比AKT的磷酸化水平顯著下調(diào)。④在阿霉素誘導(dǎo)的急性和慢性心肌毒性的心肌組織中，阿霉素提高了caspase-3的活性，而calpain-2的過(guò)表達(dá)則抵消了阿霉素引起的caspase-3活性的升高，同時(shí)增加了AKT的mRNA水平和蛋白磷酸化水平。同時(shí)，c

19、alpain-2的過(guò)表達(dá)明顯改善阿霉素引起的心肌肥大。
　　 (4) PCR擴(kuò)增出ragB和mGITRL片段，并將其克隆至真核表達(dá)載體pIRES上，獲得重組子pIRES-ragB和pIRES-ragB-mGITRL。將重組子pIRES-ragB-mGITRL轉(zhuǎn)入COS-7細(xì)胞，western blot結(jié)果顯示，檢測(cè)出RagB和mGITRL特異性條帶。
　　 (5) ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，ragB免疫組產(chǎn)生較高滴度Ra

20、gB特異性抗體(1∶32000)，而帶有佐劑GITRL組，產(chǎn)生更高滴度的特異性抗體(1∶64000)。ELISPOT分析結(jié)果表明，pIRES-ragB免疫的脾臟細(xì)胞和骨髓細(xì)胞產(chǎn)生了RagB特異性抗體形成細(xì)胞;而pIRES-ragB-mGITRL免疫組，RagB特異性抗體形成細(xì)胞增多三倍以上。同時(shí)，脾臟中細(xì)胞因子IL-21和IFN-γ mRNA水平在ragB組顯著上調(diào)，GITRL進(jìn)一步提高了兩者的mRNA水平;Tfh和IFN-γ+T細(xì)胞在

21、脾臟CD3+細(xì)胞中的比例因疫苗ragB的作用而顯著上調(diào)，佐劑GITRL進(jìn)一步上調(diào)兩者的比例。牙齦卟啉菌感染引起小鼠腹部潰瘍，疫苗的使用明顯改善潰瘍的形成，pIRES-ragB-mGITRL免疫組尤其明顯。
　　 結(jié)論：
　　 (1)成功構(gòu)建了攜帶有TetO、α-MHC啟動(dòng)子和hGH核酸序列的hcalpain-2真核表達(dá)載體，并成功導(dǎo)入小鼠受精卵獲得帶有hcalpain-2基因的小鼠。繼而與tTA轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，成功獲得心

22、肌特異性和可誘導(dǎo)性表達(dá)且各器官功能未受影響的hcalpain-2轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　 (2)成功建立了阿霉素誘導(dǎo)的小鼠急性和慢性心肌毒性模型。calpain-2的過(guò)表達(dá)，發(fā)揮了對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌毒性的保護(hù)作用，有望成為預(yù)防和治療阿霉素心肌毒性的靶點(diǎn)，從而推進(jìn)阿霉素抗癌方面的應(yīng)用。
　　 (3)在體外，Calpain-2能增強(qiáng)原代心肌細(xì)胞AKT mRNA水平和蛋白磷酸化水平;在體內(nèi)，同樣能提高心肌組織的AKT mRNA水平和

23、蛋白磷酸化水平。Calpain-2對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌毒性提供的保護(hù)作用可是通過(guò)AKT這條通路實(shí)現(xiàn)的。
　　 (4)成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pIRES-ragB和pIRES-ragB-mGITRL，并在表達(dá)細(xì)胞系COS-7細(xì)胞中有效表達(dá)。
　　 (5) DNA疫苗免疫小鼠產(chǎn)生了較高滴度的抗RagB抗體，并顯示了對(duì)牙齦卟啉菌感染的保護(hù)作用;GITRL的聯(lián)用進(jìn)一步提高疫苗的保護(hù)效率，其作用可能是通過(guò)提高脾臟中Tfh細(xì)胞的比例，從