玉米GRF--interacting Factor1(gif1)突變基因的圖位克隆及生物學(xué)功能解析.pdf

1、植物的形態(tài)建成是由細(xì)胞的不確定性與細(xì)胞命運(yùn)的決定性之間的平衡來(lái)決定。分生組織和有多向分化功能的干細(xì)胞都具有不確定性，是側(cè)生器官產(chǎn)生的基礎(chǔ)。本研究鑒定到一個(gè)分生組織確定性與不確定性平衡上存在缺陷的玉米突變體，在葉片和莖細(xì)胞中不確定性細(xì)胞減少，突變體的花序分生組織頂端扁化，失去對(duì)側(cè)生分生組織不確定性的控制。通過(guò)圖位克隆的方法確定一個(gè)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)共轉(zhuǎn)錄激活因子GROWTH REGULATING FACTOR-INTERACTING FACTOR1

2、（GIF1），是引起突變體表型變化的基因。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.突變體gif1植株及細(xì)胞學(xué)表型變異
　　與野生型相比，突變體gif1植株矮化且葉片窄;雄穗長(zhǎng)分支數(shù)目減少但雌穗基部有額外的分支發(fā)生且頂端呈現(xiàn)扁平化現(xiàn)象;突變體表現(xiàn)雌雄敗育，與其它自交系正反交均不能結(jié)實(shí)，通過(guò)雜合基因型植株自交獲得突變體。細(xì)胞學(xué)研究表明突變體gif1雌雄花序分生組織頂端扁平化且不確定性異常，突變體雄穗分支數(shù)減少且分生組織發(fā)育滯后，雌穗的分

3、支數(shù)增加;雄花序小花分生組織中穎片原基發(fā)育受到抑制，雌花序的下位花和雄蕊原基的退化進(jìn)程相對(duì)滯后。
　　2.圖位克隆鑒定突變基因?yàn)閆mGIF1
　　遺傳分析表明該突變體表型受一對(duì)隱性單基因控制。圖位克隆結(jié)果顯示候選基因位于玉米第1號(hào)染色體的長(zhǎng)臂，編碼一個(gè)GIF1的轉(zhuǎn)錄因子（GRMZM2G180246，是擬南芥AtGIF1/ANGUSTIFOLIA3（AN3）和水稻OsGIF1的同源基因。對(duì)GRMZM2G180246基因進(jìn)行重測(cè)

4、序分析發(fā)現(xiàn)，野生型和gif1突變體中植株該基因存在顯著差異，其中第3外顯子上一個(gè)51bp的序列插入是主要的變異位點(diǎn)，包括一個(gè)43bp的Popin轉(zhuǎn)座子和一個(gè)8bp的正向重復(fù)序列，轉(zhuǎn)座子插入到蛋白結(jié)構(gòu)域中，引起轉(zhuǎn)錄終止，是導(dǎo)致該基因的轉(zhuǎn)錄效率顯著降低的直接原因。
　　gif1-mum1轉(zhuǎn)座子Mu7插入到GIF1基因的5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)的突變體，通過(guò)gif1-mum1表達(dá)分析及單株及與W22的回交后代群體表型的鑒定，證明G

5、IF1是所克隆到的基因。GIF1基因組全長(zhǎng)3656bp，CDS全長(zhǎng)686bp，編碼227個(gè)氨基酸;GIF1屬于GIFs家族，是共轉(zhuǎn)錄激活因子，編碼高度保守的SNH結(jié)構(gòu)域蛋白和GRFs-N端保守結(jié)構(gòu)域QLQ特異識(shí)別，形成不同形式的互作復(fù)合物。
　　3.GIF1基因的特異性表達(dá)
　　GIF1在分生能力較強(qiáng)的組織中表達(dá)量較高，主要包括莖頂端分生組織和幼嫩的雌雄穗分生組織;GIFs和GRFs的表達(dá)模式分析表明，ZmGIF1在花序發(fā)育

6、中具有明顯的特異性，且在花序發(fā)育早期高于晚期;GRFs的表達(dá)在不同組織間存在一定的差異。原位雜交表明GIF1在SAM中除了頂端部位外不僅在幼嫩的葉原基中強(qiáng)烈表達(dá)，而且在SAM的基部即未來(lái)發(fā)育為節(jié)間的部位表達(dá);gif1突變體中，SAM和葉片無(wú)表達(dá)。在花序分生組織中，GIF1在除去頂點(diǎn)的IM中及在SPM和SM都是高水平表達(dá)的，而且在花序分生組織周圍尤其是內(nèi)外稃原基中特異富集，突變體中未檢測(cè)到表達(dá)。另外，GIF1在SM及SPM分生組織中的表達(dá)

7、方式與ramosa2(ra2)有重疊，同時(shí)ra2在突變體中的表達(dá)顯著減少，說(shuō)明二者可能在功能上存在部分重疊。
　　4.GIF1基因的調(diào)控與互作
　　利用未成熟雄穗RNA-seq分析共鑒定出1468個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)(q＜0.05)，其中在突變體gif1中上調(diào)的基因有350個(gè)，1118個(gè)為下調(diào)基因。GO聚類分析表明差異表達(dá)基因主要集中于生物過(guò)程及分子功能等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)途徑。在gif1中，幾個(gè)重要的花序發(fā)育相關(guān)基因ub3

8、、ra2、te1、zfl1/2、vt2等顯著下調(diào)，它們是腋生分生組織身份決定性和確定性（identity and determinacy）的重要調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞周期、生長(zhǎng)素合成及響應(yīng)相關(guān)的基因在gif1中顯著下調(diào)。GRFs中GRF3上調(diào)，GRF7和GRF17顯著下調(diào)，GIF2和GIF3的表達(dá)未受影響。
　　染色質(zhì)免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)GIF1以32.4％的比例結(jié)合在基因區(qū)，以12.0％結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS上游的1.0kb的啟動(dòng)子區(qū)

9、;peak附近10Kb以內(nèi)共檢測(cè)到1275個(gè)GIF1可能的靶基因，包括一些已知的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。通過(guò)ChIP-seq與RNA-seq數(shù)據(jù)比較分析共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因在gif1突變體中有50個(gè)基因與GIF1直接結(jié)合，37個(gè)基因表現(xiàn)下調(diào)，13個(gè)基因上調(diào)。
　　GIF1蛋白與16個(gè)GRFs中除了GRF7、GRF11和GRF20外的13個(gè)蛋白互作，GIF1能夠在轉(zhuǎn)錄水平上自我調(diào)節(jié)豐度，并通過(guò)直接結(jié)合UB3影響玉米雄穗的分支發(fā)育。
　　5

10、.候選基因的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)
　　通過(guò)對(duì)具有豐富的自然變異且來(lái)源于不同亞群的玉米自交系進(jìn)行重測(cè)序，檢測(cè)到最小等位基因頻率(MAF)大于0.05的多態(tài)性位點(diǎn)22個(gè)，其中5個(gè)位點(diǎn)與植株和花序發(fā)育顯著相關(guān)。主要集中在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1.0Kb左右的位置和5'-UTR區(qū)，說(shuō)明該基因的遺傳變異主要分布在轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，GIF1可能是在表達(dá)水平的調(diào)控，而不是功能上出現(xiàn)變異;表型數(shù)據(jù)與GIF1的遺傳變異進(jìn)行候選基因關(guān)聯(lián)分析，位于exon1的A/G和int