沙咪珠利對(duì)柔嫩艾美爾球蟲(chóng)誘導(dǎo)耐受及耐受機(jī)制研究.pdf

1、雞球蟲(chóng)病是由艾美爾屬球蟲(chóng)引起的一種原蟲(chóng)病，能夠?qū)е码u的生長(zhǎng)發(fā)育緩慢并制約養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。目前，藥物治療是控制雞球蟲(chóng)病的主要方法。隨著藥物的廣泛使用，雞球蟲(chóng)幾乎對(duì)所有的抗球蟲(chóng)藥物都產(chǎn)生了耐藥性。為了更好的控制雞球蟲(chóng)病，研究雞球蟲(chóng)對(duì)抗球蟲(chóng)藥物的耐藥機(jī)制和探索藥物作用靶點(diǎn)是勢(shì)在必行的。沙咪珠利是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所自主研發(fā)的具有良好抗球蟲(chóng)活性的新型抗球蟲(chóng)藥物，有良好的應(yīng)用前景。
　　為了探索柔嫩艾美爾球蟲(chóng)對(duì)沙咪珠利的耐藥機(jī)制，我

2、們研究了不同給藥劑量和盲腸組織中沙咪珠利的濃度關(guān)系，誘導(dǎo)了耐藥蟲(chóng)株，并對(duì)敏感蟲(chóng)株和耐藥蟲(chóng)株進(jìn)行了蛋白組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，以及兩組學(xué)的聯(lián)合分析。此外，對(duì)沙咪珠利溶液劑在雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，為其能夠在臨床中合理應(yīng)用提供指導(dǎo)和參考。具體結(jié)果如下:
　　1.應(yīng)用超高效液相色譜(UPLC)法建立了雞盲腸組織中沙咪珠利的含量測(cè)定方法，研究給藥劑量和雞盲腸組織中藥物含量的定量關(guān)系。將不同劑量的沙咪珠利添加到飼料中，雞自由采食8d后采集盲

3、腸組織，勻漿，乙酸乙酯提取，UPLC進(jìn)樣檢測(cè)。色譜柱為ACQUITYUPLC BEH C18柱(1.7μm，2.1×100mm)，流動(dòng)相為乙腈和水，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為251nm，柱溫30℃，流速0.2mL/min。在該檢測(cè)方法下，沙咪珠利在0.025-0.5μg/g和0.5-16.5μg/g的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性方程分別為Y=6.2156X-0.0222(R2=0.9994)和Y=1.3445X-0.1544(R2=0.9999)

4、。高、中、低濃度的樣品平均回收率在85％～106％之間，批內(nèi)和批間RSD均在10％以?xún)?nèi)。用該方法跟蹤不同給藥劑量下盲腸組織中沙咪珠利的含量，在給藥后第8d，隨著給藥劑量的增加，盲腸組織中藥物濃度增加幅度減小，為進(jìn)一步研究球蟲(chóng)對(duì)沙咪珠利產(chǎn)生的耐藥性機(jī)制提供參考。
　　為了研究沙咪珠利溶液劑在雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，建立了檢測(cè)雞血漿中沙咪珠利的檢測(cè)方法。按照低(0.67mg/kg)、中(1.33mg/kg)、高(6.67mg/kg)三

5、個(gè)劑量單次灌服。利用藥代動(dòng)力學(xué)軟件DAS3.0的非房室模型對(duì)血藥濃度時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在給藥后5.17±1.80，4.6±2.12，4.6±2.12h分別達(dá)到最大血藥濃度2.16±0.57，3.91±0.71，23.71±5.02mg/L;消除半衰期分別為10.8，10.7和13.3h。結(jié)果表明:溶液劑中沙咪珠利在雞體內(nèi)吸收快，消除緩慢，最大血藥濃度和藥時(shí)曲線(xiàn)下面積與給藥劑量呈正相關(guān)關(guān)系。
　　2.采用固定劑量法和逐漸遞增劑量法，

6、對(duì)沙咪珠利進(jìn)行耐藥株的誘導(dǎo)，經(jīng)過(guò)26次傳代分別獲得了對(duì)10mg/kg沙咪珠利和對(duì)200mg/kg沙咪珠利完全耐藥的蟲(chóng)株。在第4代對(duì)傳代球蟲(chóng)進(jìn)行了單卵囊的分離與鑒定，鑒定結(jié)果表明:用于傳代的球蟲(chóng)均為柔嫩艾美爾球蟲(chóng)。將耐藥蟲(chóng)株在飼料中不添加任何藥物的情況下傳代，誘導(dǎo)耐藥逆轉(zhuǎn)株。在第10代時(shí)，固定劑量逆轉(zhuǎn)株對(duì)10mg/kg的沙咪珠利仍然耐藥;逐漸遞增劑量組逆轉(zhuǎn)株對(duì)10mg/kg的沙咪珠利敏感。說(shuō)明逐漸遞增劑量組誘導(dǎo)獲得的耐藥性在不用藥的情況下

7、比固定劑量組獲得的耐藥性更容易恢復(fù)。
　　3.利用蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)沙咪珠利敏感的柔嫩艾美爾球蟲(chóng)蟲(chóng)株和兩種方法誘導(dǎo)的耐藥株進(jìn)行了蛋白組學(xué)分析，篩選差異蛋白，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行功能分析?？偣茶b定了1384個(gè)蛋白和7618條肽段;固定劑量耐藥株(R10)和敏感株(C)，逐漸遞增劑量耐藥株(R200)與敏感株，逐漸遞增劑量耐藥株和固定劑量耐藥株分別有222，573，620個(gè)差異蛋白。相對(duì)于敏感株，在固定劑量耐藥株和逐漸遞增劑量耐藥株中

8、有共同表達(dá)趨勢(shì)蛋白96個(gè)，主要與復(fù)制、入侵、膜組分、運(yùn)輸和糖代謝等有關(guān)，說(shuō)明球蟲(chóng)的耐藥機(jī)制是比較復(fù)雜的，并不依賴(lài)于單一因素，為進(jìn)一步研究球蟲(chóng)的耐藥性機(jī)制提供新的思路。
　　4.利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)沙咪珠利敏感的柔嫩艾美爾球蟲(chóng)蟲(chóng)株和兩種方法誘導(dǎo)的耐藥株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選差異基因，并對(duì)其進(jìn)行功能分析。R10vs C組有差異基因118個(gè)，上調(diào)42個(gè)，下調(diào)76個(gè);R200vs C有1821個(gè)顯著差異基因，上調(diào)690個(gè)，下調(diào)1131個(gè)

9、;R200vs R10有1383個(gè)顯著差異基因，上調(diào)525個(gè)，下調(diào)858個(gè)。在R10vs C和R200vs C中都顯著差異，且上下調(diào)趨勢(shì)一致的有48個(gè)，上調(diào)11個(gè)，下調(diào)37個(gè)。另外在R10vs C和R200vs C中上下調(diào)趨勢(shì)一致，但在R10vs C中差異不顯著，在R200vs C中差異顯著的有1359個(gè)，上調(diào)480個(gè)，下調(diào)879個(gè)。差異基因主要參與細(xì)胞過(guò)程，代謝過(guò)程，是細(xì)胞器和膜的主要組成部分，主要發(fā)揮結(jié)合和催化功能等，為進(jìn)一步研究球

10、蟲(chóng)的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　5.將蛋白組和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行整合分析，兩組學(xué)的相關(guān)性差，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄后加工，翻譯后修飾等影響轉(zhuǎn)錄組和蛋白組相關(guān)性的因素可能與耐藥性的形成有關(guān)。大部分差異基因/蛋白主要與代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程，結(jié)合、催化活性、細(xì)胞器和膜組分相關(guān);主要參與的代謝通路，抗生素的生物合成，次級(jí)代謝物的生物合成，碳代謝，不同環(huán)境中的微生物代謝等通路。為探索球蟲(chóng)耐藥機(jī)制提供參考和指導(dǎo)，具有重要意義。
　　綜上所述，該研究讓我們對(duì)柔嫩