由吸水鏈霉菌ATCC29253構建主要產橄欖素的基因工程菌.pdf

1、目的:
　　 洋橄欖素是1959年從生孢鏈霉菌中首次分離得到的。它具有免疫抑制、抗革蘭陽性菌、抗線蟲、抗原生動物、和抗腫瘤細胞等多種生物學活性，與化學藥劑相比，安全性高，治療效果好，易降解，對環(huán)境污染小，并且現(xiàn)已進入臨床應用。
　　 近年來，免疫抑制劑生物合成基因簇的研究引起了國內外的廣泛關注。鏈霉菌基因工程技術的發(fā)展，使得克隆次級代謝產物生物合成基因、有目的地進行基因重組和基因定向改造、提高菌種的生產能力、產生新的代謝

2、產物成為可能。
　　 而吸水鏈霉菌具有廣泛的生物學活性，其代謝產物在臨床中具有重要的應用價值?；蚬こ碳夹g在大環(huán)內酯類抗生素研究中的應用，已經成為現(xiàn)代醫(yī)學研究的熱點。通過基因工程的方法改造微生物代謝產物的化學結構與組成，對解決當前日益嚴重的致病菌耐藥性問題帶來了新的希望。
　　 由于一種微生物同時產生幾種不同的抗生素，給工業(yè)發(fā)酵生產帶來了較大的困難。選育單組分活性物質的產生菌，可以從遺傳上選擇性地只生產一種特定的生物活性

3、物質，而不再產生其他的活性成分，這樣的菌種具有產物單一，生產過程簡單，易于提取純化以及降低生產成本等許多優(yōu)點。
　　 本研究采用分子生物學的方法使產生兩種主要抗生素—雷帕霉素和洋橄欖素的吸水鏈霉菌通過失活雷帕霉素生物合成基因簇中的rapA基因，阻斷該產物的生物合成，從而獲得主要產洋橄欖素的基因工程菌，提高洋橄欖素的產量。此外，本研究對獲得的基因工程菌株進行自然分離，以得到遺傳性能穩(wěn)定的高產菌株。
　　 方法:
　　

4、 一、質粒pG07的構建
　　 以吸水鏈霉菌ATCC29253的染色體為模板，通過PCR擴增rapA基因片段，將PCR產物進行膠回收后分別與pMD18-T質粒進行連接，轉化后得到陽性克隆，然后將得到的陽性克隆擴增培養(yǎng)后提質粒，并將得到的重組質粒用酶切來驗證插入方向，選擇正確插入方向的質粒分別命名為pG01和pG04。然后再次將質粒pG01和pG04酶切，選擇目的片段進行膠回收再與pKC1139酶切后的片段16℃連接過夜，轉化E

5、.coli DH-5α感受態(tài)。通過抗性篩選得到陽性克隆，擴增培養(yǎng)細菌并提取純化獲得重組質粒pG07。
　　 二、接合轉移實驗
　　 將具有大腸桿菌-鏈霉菌接合轉移功能的重組質粒pG07轉化E.coli ET12567(pUZ8002)，篩選陽性克隆。經一級、二級培養(yǎng)后與經過50℃熱激活的出發(fā)菌株吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus ATCC29253）單孢子懸液混合，涂布于2CM平板上，16小

6、時后，用一定濃度的安普霉素和萘啶酮酸水溶液覆蓋，28℃繼續(xù)培養(yǎng)。7天后觀察是否有陽性克隆長出。
　　 三、雙交換菌株的篩選
　　 挑取接合轉移后的陽性克隆菌落，涂布在含有安普霉素的MYM平板上培養(yǎng)。收集孢子制備成孢子懸液，稀釋一定倍數(shù)后涂布于含有安普霉素的MYM平板上，28℃培養(yǎng)48-72小時，在未形成氣生菌絲時，將平板移至42℃繼續(xù)培養(yǎng)3-4天，能夠繼續(xù)生長的菌株即為單交換菌株。
　　 將單交換菌株在不添加抗生

7、素的MYM平板上傳代，篩選失去安普霉素抗性的菌株即為雙交換重組菌株。
　　 四、重組菌株的HPLC分析
　　 將篩選出的雙交換重組菌株與出發(fā)菌株分別傳于斜面培養(yǎng)基上，再接種于種子搖瓶內，于28℃培養(yǎng)40小時，轉入發(fā)酵搖瓶，于28℃培養(yǎng)5天。
　　 發(fā)酵液提取物采用高效液相色譜（HPLC）進行分析。
　　 結果:
　　 一、質粒pG07的酶切鑒定
　　 將質粒pG07進行酶切驗證，并以pG0

8、7為模板，進行PCR擴增反應。酶切及PCR產物采用0.8％瓊脂糖凝膠電泳，圖譜顯示酶切后片段的長度與預期結果一致，并且PCR擴增出的片段大小約2853bp，正好為基因缺失后的長度，說明質粒pG07構建正確。
　　 二、接合轉移實驗
　　 E.coli ET12567(pUZ8002，pG07)與吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicusATCC29253）共同培養(yǎng)后，在有安普霉素的平皿上有鏈霉菌的陽

9、性克隆長出，說明質粒pG07攜帶的安普霉素抗性基因已經在鏈霉菌中表達，質粒pG07已經成功轉入到吸水鏈霉菌ATCC29253中。
　　 三、雙交換菌株的篩選及高效液相色譜(HPLC)的分析結果
　　 對重組菌株染色體進行PCR驗證，結果表明，重組質粒上失活的rapA基因與出發(fā)菌株染色體上正常的rapA基因發(fā)生了正確的同源雙交換。
　　 發(fā)酵產物的HPLC分析表明:基因重組菌株產生的代謝產物中雷帕霉素的產量顯著減少

10、了62％，而另一代謝產物洋橄欖素的產量有所提高。
　　 結論:
　　 1、成功地刪除了吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus ATCC29253）中雷帕霉素生物合成基因簇中的rapA基因的內部片段，造成rapA基因的失活，得到了基因重組菌株。經發(fā)酵產物的HPLC分析表明:重組菌株雷帕霉素產量顯著減少而洋橄欖素產量有所提高。
　　 2、對重組菌株染色體DNA上的rapA基因進行了PCR驗證