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文檔簡(jiǎn)介
1、禽多瘤病毒感染癥(Avian Polyomavirus infection,APV感染癥)和鸚鵡喙羽病(Psittacine Beak and Feather Disease,PBFD)被認(rèn)為是影響禽類羽毛和外觀的兩大代表性疾病。鸚鵡喙羽病病毒(PBFDV),屬于圓環(huán)狀病毒科(Circoviridae)環(huán)狀病毒(Circovirus),可感染約60種的野生及寵物鸚鵡,能引起患烏免疫抑制,危害嚴(yán)重。此病在我國(guó)臺(tái)灣有過報(bào)道,在大陸還未曾見過
2、報(bào)道。APV感染癥,又稱鸚鵡幼雛病,主要引起鸚鵡幼雛的急性致死性疾病,其死亡率可高達(dá)100%。本文主要完成了以下工作:
(1)利用PCR方法對(duì)來自山東的9份瀕死虎皮鸚鵡病料進(jìn)行APV和PBFDV的檢測(cè),9份病料中有6份PCR檢測(cè)為APV陽性,1份檢測(cè)為PBFDV陽性,2份為APV和PBFDV混合感染,PCR產(chǎn)物序列分析的結(jié)果可以確認(rèn)本病例鸚鵡有PBFDV和APV的感染,這是我國(guó)大陸首次報(bào)道鸚鵡喙羽病,也是我國(guó)大陸首次報(bào)道虎
3、皮鸚鵡APV和PBFDV的混合感染。
(2)利用分段PCR擴(kuò)增的方法對(duì)APV和PBFDV的全基因組進(jìn)行了擴(kuò)增,測(cè)序結(jié)果分析可知,本文分離到了2株APV分離株,一株為青島株QD-JM01,一株為濰坊株WF-GM01;此外,在青島養(yǎng)殖場(chǎng)還分離到一株P(guān)BFDV分離株QD-CN01,為我國(guó)大陸分離到的第一株P(guān)BFDV。
Blast分析,綜合DNAstar軟件分析可知,APV分離株QD-JM01株和WF-GM01與Ge
4、nBank中全部的APV毒株同源性極高,為99.3%~99.9%。全基因組序列多重比對(duì)分析表明,QD-JM01株共有11處發(fā)生了核苷酸變異,最顯著的是在第246位(非編碼區(qū))插入了14個(gè)堿基,有3處能引起氨基酸的變異。WF-GM01株有14個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基改變,其中VP1變異率最高,有5個(gè)堿基位點(diǎn)發(fā)生改變。其次T抗原變異率較高,有4處堿基發(fā)生改變,其中,VP1區(qū)域及T抗原分別有4個(gè)位點(diǎn)引起氨基酸變異。PBFDV青島分離株QD-CN01,全
5、長(zhǎng)2003bp,與GenBank中已發(fā)表PBFDV分離株全序列同源性為83.0%~95.0%。與之前報(bào)道的PBFDV呈現(xiàn)相似的基因組結(jié)構(gòu),包括主要ORF的大小以及位置,位于Cap和Rep之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列及位置等。利用Mega4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析表明這些同源性極高的APV分離株,與地理分布沒有明顯關(guān)聯(lián),并不形成地理隔離,與宿主也不呈明顯關(guān)聯(lián);來源于不同宿主的PBFDV分離株與宿主關(guān)系緊密,與地理來源也呈一定相關(guān),我國(guó)的QD-
6、CN01分離株位于由6株分離自日本的分離株構(gòu)成的虎皮鸚鵡特異基因型分支上。
(3)根據(jù)已測(cè)鸚鵡喙羽病病毒青島分離株(QD-CN01)全基因序列,設(shè)計(jì)一對(duì)表達(dá)QD-CN01株ORFC1基因(750bp)的引物,將其克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)獲得重組pET-ORFC1質(zhì)粒。通過對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間,IPTG終濃度,以及菌體OD值進(jìn)行篩選優(yōu)化,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功地在BL21宿主菌中表達(dá)分子量約為28.9kDa的融合蛋白。蛋白
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