艾灸對亞健康腦力疲勞模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力與海馬神經(jīng)元的影響.pdf

1、目的：觀察艾灸“印堂”與“神闕”穴對亞健康腦力疲勞模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用艾灸印堂與神闕調(diào)治亞健康腦力疲勞提供現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論依據(jù)。本課題的研究目的具體包括以下4個(gè)方面。
　　 (1)建立并評價(jià)部分睡眠剝奪所致亞健康腦力疲勞大鼠動物模型，觀察艾灸“印堂”與“神闕”穴對模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　 (2)探討部分睡眠剝奪對模型大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(hypothalamus-pituit

2、ary-adrenocortex axis，HPA)相關(guān)激素水平的影響，觀察艾灸“印堂”與“神闕”穴對HPA軸激素水平的調(diào)節(jié)作用。
　　 (3)觀測部分睡眠剝奪所致亞健康腦力疲勞模型大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，探討艾灸“印堂”與“神闕”穴對海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響。
　　 (4)檢測部分睡眠剝奪所致亞健康腦力疲勞模型大鼠海馬細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化，探討艾灸“印堂”與“神闕”穴對模型大鼠海馬細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

3、>　　 方法：采用隨機(jī)對照的動物實(shí)驗(yàn)研究方法進(jìn)行本課題研究。實(shí)驗(yàn)分為以下4個(gè)部分。
　　 (1)將健康成年SD大鼠30只(雌雄各半)按體重大小及雌雄隨機(jī)分成3組：正常組、模型組和艾灸組，每組10只。模型組和艾灸組采用睡眠剝奪水箱進(jìn)行每天不足5-6小時(shí)睡眠的睡眠剝奪，正常組在同一時(shí)間段內(nèi)放入模擬水環(huán)境水箱內(nèi)，連續(xù)14天。造模期間，艾灸組另給予艾灸“印堂”與“神闕”穴，每穴每次灸15分鐘，每天1次。觀察3組大鼠的一般狀況，并每周稱

4、重一次。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第2周，采用八臂迷宮對3組大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練，并檢測其學(xué)習(xí)記憶能力。
　　 (2)實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，處死大鼠并采血。采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測各組大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素(adronocorticotropic hormone，簡寫為ACTH)和內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，簡寫為GC)濃度。
　　 (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天處死大鼠后取材并制作標(biāo)本。組織病理切片觀察3組大

5、鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)，原位末端標(biāo)記法(TUNEL法)觀測海馬細(xì)胞凋亡情況。
　　 (4)采用免疫組織化學(xué)法檢測3組大鼠海馬CA3區(qū)Bcl-2、Bax與Caspase-3等凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：上述實(shí)驗(yàn)完成后，得到如下觀測結(jié)果。
　　 (1)一般狀況：實(shí)驗(yàn)前，3組大鼠一般狀況好。實(shí)驗(yàn)開始造模初期，模型組與艾灸組大鼠外觀無明顯改變，但其行為的興奮性與警覺性提高，對周圍刺激反應(yīng)敏捷。隨著造模時(shí)

6、間的延長，模型組與艾灸組大鼠披毛毛色逐漸發(fā)黃而少光澤，且開始出現(xiàn)掉毛，表現(xiàn)出易“激惹”現(xiàn)象，對抓取、撫摸等刺激表現(xiàn)出逃避行為。造模1周后，模型組大鼠明顯消瘦，披毛蓬亂，毛色枯黃無光澤且容易掉落，出現(xiàn)疲勞與虛弱行為。正常對照組從實(shí)驗(yàn)開始到結(jié)束，外觀表現(xiàn)大致如實(shí)驗(yàn)前。艾灸組自造模1周起外觀與行為表現(xiàn)介于正常組和模型組之間。
　　 (2)體重變化：正常組實(shí)驗(yàn)第7天與實(shí)驗(yàn)前相比體重增加，但差異無顯著性(P>0.05)；模型組、艾灸組實(shí)驗(yàn)

7、第7天與實(shí)驗(yàn)前相比，體重均減輕，差異有顯著性(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)第7天，模型組與艾灸組大鼠體重比較，差異無顯著性(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)第7天及第14天，模型組、艾灸組體重與正常組相比為輕，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 (3)八臂迷宮訓(xùn)練成績：3組大鼠覓食時(shí)間比較，模型組最長，艾灸組次之，正常組最短，3組之間兩兩比較，差異均有顯著性(P<0.01)。自訓(xùn)練測試第3天起，正常組及艾灸組錯(cuò)誤臂數(shù)與模型組比較均為少(P<0.0

8、5)，艾灸組與正常組錯(cuò)誤臂數(shù)比較，差異無顯著性(P>0.05)。自訓(xùn)練測試第5天起，正常組及艾灸組正確臂數(shù)與模型組比較均為多(P<0.05)。
　　 (4)血清ACTH與GC濃度：模型組及艾灸組血清ACTH濃度明顯高于正常組(P<0.05)，艾灸組血清ACTH濃度明顯低于模型組(P<0.05)。模型組血清GC濃度明顯高于正常組(P<0.05)；艾灸組GC濃度明顯低于模型組(P<0.05)，與正常組比較，差異無顯著性(P>0.05

9、)。
　　 (5)海馬切片神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
　　 海馬切片HE染色后光鏡可見：正常組海馬CA3區(qū)有大量排列規(guī)則整齊的錐體細(xì)胞，模型組錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量減少，艾灸組錐體細(xì)胞排列比較規(guī)則、整齊。
　　 海馬切片細(xì)胞凋亡觀察可見：正常組海馬組織可見少量TUNEL陽性細(xì)胞，模型組及艾灸組陽性細(xì)胞散布于整個(gè)海馬組織；艾灸組陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于模型組(P<0.05)，艾灸組陽性細(xì)胞數(shù)與正常組比較，差異無顯著性(P

10、>0.05)。
　　 (6)海馬切片免疫組化染色后光鏡觀察結(jié)果
　　 Bcl-2蛋白檢測結(jié)果：與正常組比較，模型組、艾灸組Bcl-2蛋白陽性細(xì)胞數(shù)目均為多(P<0.05)；艾灸組Bcl-2蛋白陽性細(xì)胞數(shù)目較模型組多，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 Bax蛋白檢測結(jié)果：與正常組比較，模型組、艾灸組Bax蛋白陽性細(xì)胞數(shù)目均為多(P<0.05)；艾灸組Bax蛋白陽性細(xì)胞數(shù)目較模型組少，差異有顯著性(P<0.05)

11、。
　　 Caspase-3蛋白檢測結(jié)果：與正常組比較，模型組與艾灸組Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)目均為多(P<0.05)；艾灸組Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)目較模型組比較少，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 結(jié)論：通過本課題研究，可以得出以下結(jié)論。
　　 (1)采用每天不足5-6小時(shí)睡眠、連續(xù)14天的部分剝奪睡眠方法建立的亞健康腦力疲勞大鼠模型，其行為學(xué)與人類亞健康腦力疲勞臨床表現(xiàn)相類似，是研究亞健

12、康腦力疲勞較為理想的動物模型。
　　 (2)艾灸“印堂”與“神闕”穴具有改善亞健康腦力疲勞模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力等亞健康樣癥狀的作用。
　　 (3)HPA軸功能亢進(jìn)，高GC水平下進(jìn)而引起的海馬損傷，是亞健康腦力疲勞發(fā)生的機(jī)制之一。艾灸“印堂”與“神闕”穴具有調(diào)節(jié)亞健康腦力疲勞模型大鼠HPA軸的功能，這是艾灸能夠改善亞健康腦力疲勞模型大鼠亞健康樣癥狀的機(jī)制之一。
　　 (4)艾灸“印堂”與“神闕”穴可以阻止腦力疲勞模

13、型大鼠海馬錐體細(xì)胞帶神經(jīng)元丟失，減輕海馬神經(jīng)元損傷，維持海馬神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)；艾灸還可以抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，保護(hù)海馬神經(jīng)元。
　　 (5)睡眠剝奪導(dǎo)致模型大鼠海馬神經(jīng)元Bax與Casepase-3基因蛋白表達(dá)增加，促使海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，是亞健康腦力疲勞的又一發(fā)生機(jī)制。艾灸“印堂”與“神闕”穴可通過下調(diào)海馬促凋亡蛋白Bax及凋亡相關(guān)酶Casepase-3的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而抑制大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)