變異鏈球菌中抗壞血酸特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)相關(guān)基因的初步研究.pdf

1、目的：
　　鑒于ptxA基因在S.mutans抗壞血酸代謝中發(fā)揮的重要作用，為了探究ptxA基因上游的ptxB基因是否也發(fā)揮著類似的作用，并明確它們之間的關(guān)系，本研究擬構(gòu)建ptxB基因缺陷菌株和ptxA、ptxB基因雙重缺陷菌株，及其功能補(bǔ)償菌株，研究上述缺陷菌株和補(bǔ)償菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長、產(chǎn)酸、耐酸、合成胞外多糖及形成生物膜的能力，明確ptxA、ptxB基因?qū).mutans生物學(xué)特性的影響。此外，對(duì)ptxA、pt

2、xB基因及其鄰近基因的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析，以加深對(duì)S.mutans抗壞血酸特異性PTS的理解。
　　第一章 變異鏈球菌ptxA、ptxB基因缺陷菌株及其功能補(bǔ)償菌株的構(gòu)建
　　目的:
　　構(gòu)建ptxB基因缺陷菌株和ptxA、ptxB基因雙重缺陷菌株，并另外構(gòu)建ptxA功能補(bǔ)償菌株、ptxB功能補(bǔ)償菌株和ptxA、ptxB功能補(bǔ)償菌株，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　根據(jù)S.mutans UA159全基因

3、組的序列，采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因的上下游引物，并PCR擴(kuò)增上下游片段。以pFW5質(zhì)粒為載體，通過雙酶切，將上下游片段插入至質(zhì)粒的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建目的基因缺陷的重組質(zhì)粒。而后，在感受態(tài)刺激肽的作用下，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入野生型S.mutansUA159中，構(gòu)建基因缺陷菌株。利用類似方法，以pDL278質(zhì)粒為載體，構(gòu)建功能補(bǔ)償質(zhì)粒，而后轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的基因缺陷菌株中，構(gòu)建功能補(bǔ)償菌株。
　　結(jié)果:

4、>　　經(jīng)過PCR鑒定和測(cè)序鑒定，ptxB缺陷菌株（ptxB-）、ptxAB雙重基因缺陷菌株（ptxAB-）、ptxA功能補(bǔ)償菌株（CptxA-）、ptxB功能補(bǔ)償菌株（CptxB-）和ptxAB功能補(bǔ)償菌株（CptxAB-）構(gòu)建成功。
　　第二章 變異鏈球菌ptxA、ptxB基因?qū)ζ渖飳W(xué)特性的影響
　　目的:
　　研究S.mutans UA159、ptxA-菌株、ptxB-菌株、ptxAB-菌株、CptxA-菌株、C

5、ptxB-菌株、CptxAB-菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長、產(chǎn)酸、耐酸、胞外多糖合成及生物膜形成能力，明確ptxA、ptxB基因?qū).mutans生物學(xué)特性的影響。
　　方法:
　　1.配制抗壞血酸特異性培養(yǎng)基。采用胰蛋白胨-維生素培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加濃度為15 mmol/L的抗壞血酸，以提供S.mutans生長所需的碳源。
　　2.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長情況。將S.mutans UA15

6、9、ptxA-菌株、ptxB-菌株、ptxAB-菌株、CptxA-菌株、CptxB-菌株、CptxAB-菌株分別加入至抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)72 h。期間每隔2h測(cè)量各菌液的OD600值，繪制各菌株的生長曲線。
　　3.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸能力。將7種菌株分別加入至抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組加入至BHI培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)前、培養(yǎng)24 h后及培養(yǎng)48 h后分別測(cè)

7、量各培養(yǎng)基的pH值，計(jì)算各菌株培養(yǎng)前后的△pH值。
　　4.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的耐酸能力。將7種菌株置于抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)至OD600≈0.3，離心，收集菌胞，加入至pH5.0的抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中，37℃厭氧孵育1h進(jìn)行酸適應(yīng)。而后，采用0.1mol/L，pH7.0的甘氨酸溶液洗滌，0.1 mol/L，pH2.8的甘氨酸溶液重懸，并靜置0，15，30，45 min，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行酸沖擊。隨后，將

8、菌液進(jìn)行梯度稀釋，涂板，37℃厭氧培養(yǎng)48h后觀察平板上的菌落數(shù)。
　　5.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生物膜形成能力。將7種菌株分別加入至抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移至已放置好無菌蓋玻片的六孔板中，37℃厭氧培養(yǎng)120 h。經(jīng)過洗滌、干燥，使用SYTO9對(duì)細(xì)菌形成的生物膜進(jìn)行染色，激光共聚焦顯微鏡觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行拍照。使用Image J軟件對(duì)所有照片進(jìn)行分析，計(jì)算生物膜平均的覆蓋面積。
　　6.探究各菌

9、株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的胞外多糖合成能力。將7種菌株分別加入至抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移至已放置好無菌蓋玻片的六孔板中，37℃厭氧培養(yǎng)120 h。經(jīng)過洗滌、干燥，使用Calcofluor White對(duì)細(xì)菌合成的胞外多糖進(jìn)行染色，激光共聚焦顯微鏡觀察。
　　結(jié)果:
　　1.與野生型S.mutans UA159相比，缺陷株的生長能力受到明顯影響。ptxA缺陷菌株的遲緩期延長，其終末菌密度降低。ptxB缺陷菌株與ptxAB

10、雙重基因缺陷菌株在監(jiān)測(cè)的72 h內(nèi)未見明顯增長。ptxA功能補(bǔ)償菌株和ptxAB功能補(bǔ)償菌株可在一定程度上補(bǔ)償缺陷菌株的生長能力，但仍未達(dá)到野生株的水平。而ptxB功能補(bǔ)償菌株無法對(duì)缺陷菌株的生長能力進(jìn)行補(bǔ)償。
　　2.野生株、缺陷株和補(bǔ)償株在BHI培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸能力相同，而在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中不同。培養(yǎng)24 h后，野生株UA159培養(yǎng)基的pH值輕微下降，而三種缺陷菌株培養(yǎng)基的pH值基本不變，與野生株相比，△pH的差異均具有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ptxA、ptxAB功能補(bǔ)償菌株可在一定程度上補(bǔ)償缺陷菌株的產(chǎn)酸能力，但ptxB功能補(bǔ)償菌株卻無法對(duì)此進(jìn)行補(bǔ)償。在培養(yǎng)48 h后，各菌株培養(yǎng)基的pH值進(jìn)一步下降，且野生株和缺陷株在產(chǎn)酸能力上的差異更加明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　3.經(jīng)過1 h pH5.0的酸適應(yīng)和15 min pH2.8的酸沖擊后，三種缺陷菌均無法在瓊脂平板上長出。
　　4.經(jīng)SYTO9染色的細(xì)菌生物膜呈現(xiàn)綠色。野生

12、株UA159形成的生物膜較為致密，細(xì)菌團(tuán)塊較大，遍布整個(gè)視野，覆蓋面積為65.93％。ptxA基因缺陷菌株所形成的生物膜較野生型稀疏，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，存在不規(guī)則圓形或橢圓形大小不一的孔隙，覆蓋面積僅為39.61％。ptxB、ptxAB基因缺陷菌株無法形成具有三維結(jié)構(gòu)的生物膜，細(xì)菌呈短鏈狀排列，散在分布，覆蓋面積分別為24.24％和18.57％。ptxA、ptxAB功能補(bǔ)償菌株形成的生物膜與野生株相似，但孔隙較大，而ptxB功能補(bǔ)償菌株無法恢

13、復(fù)至野生株的水平。
　　5.經(jīng)Calcofluor White染色的細(xì)菌胞外多糖呈現(xiàn)藍(lán)色。各菌株合成胞外多糖的情況與其形成生物膜的情況類似，胞外多糖的分布與生物膜的分布基本一致。ptxA、ptxB、ptxAB基因缺陷菌株所合成的胞外多糖較野生株明顯減少。
　　結(jié)論:
　　1.S.mutans的ptxA、ptxB基因與抗壞血酸的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝密切相關(guān)。
　　2.ptxA、ptxB基因的缺陷可影響S.mutans在抗壞血酸

14、特異性培養(yǎng)基中的生長、產(chǎn)酸、耐酸、胞外多糖合成及生物膜形成能力。
　　第三章 變異鏈球菌ptxA、ptxB基因及其鄰近基因轉(zhuǎn)錄情況的研究
　　目的:
　　分析S.mutans中ptxA、ptxB基因及其鄰近的sgaT、SMU.273、SMU.274、SMU.275基因的轉(zhuǎn)錄情況，探究在S.mutans中是否存在與抗壞血酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝相關(guān)的操縱子。
　　方法:
　　1.對(duì)ptxA、ptxB基因及其鄰近基因進(jìn)行PC

15、R分析。提取S.mutans的基因組DNA及總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)S.mutans的全基因組序列，跨越SMU.268與sgaT(a)，sgaT與ptxB(b)，ptxB與ptxA(c)，ptxA與SMU.273(d)，SMU.273與SMU.274(e)，SMU.274與SMU.275(f)，SMU.275與SMU.277(g)設(shè)計(jì)引物，實(shí)驗(yàn)組以cDNA為模版，陽性對(duì)照組以基因組DNA為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂

16、糖凝膠電泳，觀察實(shí)驗(yàn)組是否出現(xiàn)與陽性對(duì)照組大小一致的條帶。
　　2.qRT-PCR檢測(cè)抗壞血酸對(duì)S.mutans中ptxA、ptxB基因及其鄰近基因表達(dá)的影響。將野生型S.mutans分別置于抗壞血酸或葡萄糖特異性培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長后期，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以16S rRNA為內(nèi)參，使用qRT-PCR檢測(cè)抗壞血酸對(duì)ptxA、ptxB基因及其鄰近基因表達(dá)的影響。
　　3.使用qRT-PCR檢測(cè)野生型S.m

17、utans及ptxB基因缺陷菌株中ptxA基因的表達(dá)情況。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS20.0軟件對(duì)qRT-PCR的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法，P＜0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.瓊脂糖凝膠電泳顯示，b、c、d、e、f的實(shí)驗(yàn)組在與陽性對(duì)照組一致的位置上出現(xiàn)了條帶，而a和g的實(shí)驗(yàn)組未出現(xiàn)條帶。
　　2.在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中，S.mutans UA159菌株的sgaT，

18、ptxB，ptxA，SMU.273，SMU.274，SMU.275基因的mRNA表達(dá)量均顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.與野生型S.mutans相比，ptxB基因缺陷菌株中ptxA基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量值明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.S.mutans的ptxA，ptxB基因與其上游的sgaT基因，及其下游的SMU.273，SMU.274，SMU.275基因