基于氮唑類抗真菌藥物設計合成的熒光探針及其真菌細胞成像應用.pdf

1、氮唑類抗真菌藥物作用靶點是羊毛甾醇14-α去甲基化酶（sterol14α-demethylase，又名CYP51）。準確探究氮唑類藥物與CYP51酶的結合模式，有利于從靶酶角度設計合成活性更好的化合物。利用小分子熒光探針技術，與藥物偶聯(lián)，作為一種可視化工具，可對藥物在細胞內(nèi)的分布、與靶點結合或相互作用情況進行示蹤。然而部分小分子熒光染料自身存在一些不足：1.脂溶性差，不易透過細胞膜，進入真菌細胞;2.染料發(fā)射光譜位于紫外及可見光區(qū)，而生

2、物體及其組織在可見光的激發(fā)下自身會發(fā)射熒光，導致嚴重背景干擾，不適于細胞生物成像;3.染料始終帶有熒光，需要洗去以降低背景，應用步驟繁瑣，成像信噪比低。本文的研究目的是設計合成基于氮唑類抗真菌藥物的小分子熒光探針用于真菌細胞CYP51酶成像并利用探針工具初步建立一種體外篩選化合物抗真菌活性的新方法。
　　新型的硅基羅丹明染料，在保留傳統(tǒng)羅丹明染料成像優(yōu)點的同時，通過硅原子取代橋連氧原子，使自身發(fā)射波長紅移至近紅外光區(qū)(600～90

3、0nm)從而適用于生物成像。我們在其基礎上引入內(nèi)酯螺環(huán)，合成出一種具有熒光“關-開”機制的新型探針。即未與靶點識別時探針自聚，內(nèi)酯螺環(huán)封閉于自聚體內(nèi)部，同時閉環(huán)，熒光淬滅;與靶點結合后自聚體解聚，同時通過內(nèi)酯螺環(huán)開環(huán)產(chǎn)生熒光。我們選取氟康唑作為偶聯(lián)藥物，在其側鏈引入長鏈連接子，通過縮合反應與兩個不同結構的硅基羅丹明染料底物偶聯(lián)，合成得到探針SiR-1，SiR-2。體外抗菌活性實驗和計算機模擬結果顯示兩者均能進入CYP51活性口袋，與靶酶

4、結合，發(fā)揮抑菌作用。光譜性質(zhì)證實兩個探針能產(chǎn)生自聚效應調(diào)控熒光的產(chǎn)生與淬滅。
　　以體外實驗作為基礎，進一步，我們利用探針對真菌細胞成像。激光共聚焦實驗表明，探針能順利的進入真菌細胞中，并能夠在“No-wash”的情況下對CYP51進行特異性成像。隨后我們設計了一系列加藥競爭性實驗，發(fā)現(xiàn)不同濃度的氟康唑在真菌細胞內(nèi)使探針熒光不同程度降低，而加入陰性對照藥（作用于其他靶點的抗真菌藥物）兩性霉素B和89b均不能使熒光明顯降低。接著我們

5、利用探針對耐藥白念珠菌和敏感白念珠菌進行成像，發(fā)現(xiàn)在耐藥菌中加入氟康唑后探針熒光降低不明顯，推測這可能由于耐藥菌阻止或外排氟康唑所致。最后我們采用熒光酶標儀定性測定不同濃度氟康唑及伊曲康唑?qū)φ婢毎刑结槦晒饨档偷挠绊憽Ｒ詿晒饨档吐屎饬克幬锘钚?，從藥物與靶酶結合的角度，初步建立了一種體外篩選化合物抗真菌活性的新方法。
　　綜上，本課題設計合成出了兩個新型氟康唑小分子熒光探針并將其應用到了鮮為研究的真菌細胞中，對CYP51進行特異性