步行訓(xùn)練對(duì)脊髓損傷大鼠步行CPG內(nèi)興奮性中間神經(jīng)元可塑性的影響.pdf

1、目的：本研究擬結(jié)合18F-FDG-micro-PET/CT觀察SCI大鼠腰段脊髓的代謝程度從而推斷CPG在脊髓受損及步行訓(xùn)練刺激的條件下能否激活。
　　本課題取T10節(jié)段不完全脊髓損傷大鼠模型，對(duì)其進(jìn)行6周的跑臺(tái)步行訓(xùn)練干預(yù)。通過(guò)定期評(píng)價(jià)三組大鼠BBB行為學(xué)評(píng)分，觀察大鼠腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板的數(shù)量及形態(tài)學(xué)變化，采用18F-FDG-Micro PET/CT、尼式染色及免疫熒光染色觀察大鼠脊髓腰段CPG的代謝水平和谷氨酸能、去甲腎上腺素能、

2、多巴胺能興奮性神經(jīng)元功能狀態(tài)，分別從行為學(xué)、組織學(xué)、免疫化學(xué)、代謝等方面系統(tǒng)觀察步行訓(xùn)練對(duì)SCI大鼠腰段步行CPG的影響，并探索CPG內(nèi)優(yōu)勢(shì)中間神經(jīng)元成份，為尋找新的有效的脊髓損傷康復(fù)策略提供新的思路。
　　方法：1.研究對(duì)象:SD大鼠45只，隨機(jī)分為步行訓(xùn)練組(n=15)、損傷對(duì)照組(n=15)、假手術(shù)組（只打開(kāi)椎板，不造成脊髓損傷）(n=15);脊髓損傷組采用NYU法建立中度T10不完全脊髓損傷模型。
　　2.研究方法<

3、br>　　造模分組后，對(duì)步行訓(xùn)練組按預(yù)設(shè)方案進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組和假手術(shù)組常規(guī)飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何干預(yù);定期觀察各組大鼠BBB評(píng)分，術(shù)后7周利用micro-PET/CT掃描觀察各組大鼠CPG代謝水平，取材后行免疫熒光染色、尼式染色觀察步行CPG中間神經(jīng)元數(shù)量和表達(dá)，利用乙酰膽堿酯酶染色觀察腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.BBB評(píng)分:
　　Sham組大鼠在麻醉完全清醒后已基本可以正常行走，在術(shù)后第1天便恢復(fù)至術(shù)前運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，BBB

4、評(píng)分均在20-21分。SCI大鼠術(shù)后早期，后肢運(yùn)動(dòng)功能嚴(yán)重受限， BBB評(píng)分在0-1分。在脊髓損傷后2周，步行訓(xùn)練組大鼠已間斷出現(xiàn)雙下肢髖、膝、踝三關(guān)節(jié)的活動(dòng)，BBB評(píng)分為5.67±1.03分，明顯高于對(duì)照組評(píng)分（P＜0.05）。損傷對(duì)照組大鼠在傷后2周，偶爾可見(jiàn)髖或膝關(guān)節(jié)的活動(dòng)，BBB評(píng)分為2.83±0.75分。隨時(shí)間進(jìn)展，步行訓(xùn)練組大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)速度較快，在各時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分結(jié)果均優(yōu)于損傷對(duì)照組大鼠（P＜0.05）。到術(shù)后

5、49天時(shí)，步行訓(xùn)練組大鼠已能夠在步行時(shí)腳掌持續(xù)負(fù)重且前后肢動(dòng)作協(xié)調(diào)，BBB評(píng)分平均達(dá)到16.08±0.80分，明顯高于損傷對(duì)照組14.08±0.66分（P＜0.05。
　　2.CPG代謝水平
　　傷后50天，miero-PET/CT結(jié)果顯示，損傷對(duì)照組大鼠腰段ROI核素平均攝取值為0.145±0.081％ID/g，與Sham組大鼠腰段ROI核素平均攝取值0.139±0.026％ID/g相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），步

6、行訓(xùn)練組大鼠腰段ROI核素平均攝取值為0.284±0.053％ID/g，顯著高于損傷對(duì)照組及Sham組。
　　對(duì)損傷對(duì)照組及步行訓(xùn)練組大鼠腰段CPG18F-FDG平均攝取值與BBB評(píng)分進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)不同干預(yù)手段下脊髓損傷大鼠腰段CPG18F-FDG平均攝取值與BBB評(píng)分之間存在顯著相關(guān)關(guān)系，即對(duì)SCI大鼠進(jìn)行步行訓(xùn)練，其后肢的運(yùn)動(dòng)功能可隨著腰段CPG代謝活動(dòng)增強(qiáng)而提高。
　　3.L1-2脊髓總體神經(jīng)元數(shù)量
　　損傷

7、對(duì)照組（94.2±9.86個(gè)/視野）大鼠中間神經(jīng)元數(shù)量與Sham組(123.2±11.00個(gè)/視野)相比減少(P＜0.05)，采用步行訓(xùn)練進(jìn)行干預(yù)可以維持CPG中間神經(jīng)元的數(shù)量（131.2±10.03個(gè)/視野），與損傷對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），與Sham組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　4.L1-2脊髓三類興奮性中間神經(jīng)元數(shù)量及表達(dá)
　　谷氨酸能中間神經(jīng)元:計(jì)數(shù):Sham組步行CPG內(nèi)谷氨酸能INs計(jì)數(shù)

8、118.67±2.30個(gè)/視野，損傷對(duì)照組步行CPG內(nèi)谷氨酸能INs計(jì)數(shù)118.80±4.21個(gè)/視野，與Sham組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，訓(xùn)練組步行CPG內(nèi)谷氨酸能INs數(shù)量明顯增多，達(dá)到135.80±6.46個(gè)/視野，顯著高于Sham組與損傷對(duì)照組(P＜0.05)。平均熒光強(qiáng)度:Sham組步行CPG內(nèi)谷氨酸能INs的MFI為0.0780±0.0172，脊髓損傷大鼠腰段CPG內(nèi)谷氨酸能INs的MFI出現(xiàn)增多，達(dá)0.197

9、5±0.0193，顯著高于Sham組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，6周步行訓(xùn)練后谷氨酸能INs的MFI出現(xiàn)進(jìn)一步升高，達(dá)0.3559±0.0027，顯著高于損傷對(duì)照組及Sham組（P＜0.05）。
　　去甲腎上腺素能INs:計(jì)數(shù):Sham組步行CPG內(nèi)去甲腎上腺素能INs計(jì)數(shù)83.80±4.71個(gè)/視野，損傷對(duì)照組步行CPG內(nèi)去甲腎上腺素能INs計(jì)數(shù)為83.60±5.22個(gè)/視野，與Sham組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)

10、，訓(xùn)練組大鼠步行CPG內(nèi)去甲腎上腺素能INs計(jì)數(shù)89.60±3.21個(gè)/視野，與Sham組與損傷對(duì)照組對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。平均熒光強(qiáng)度:Sham組步行CPG內(nèi)去甲腎上腺素能INs的MFI為0.1120±0.0236，在損傷對(duì)照組大鼠腰段CPG內(nèi)去甲腎上腺素能INs的MFI升高至0.1588±0.0114，顯著高于Sham組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，6周步行訓(xùn)練后，去甲腎上腺素能INs的MFI進(jìn)一步升高至0.3172±

11、0.0165，顯著高于損傷對(duì)照組及Sham組(P＜0.05)。
　　多巴胺能INs:計(jì)數(shù):Sham組步行CPG內(nèi)多巴胺能INs計(jì)數(shù)為81.00±5.34個(gè)/視野，損傷對(duì)照組步行CPG內(nèi)多巴胺能INs計(jì)數(shù)為80.20±4.66個(gè)/視野，與Sham組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，訓(xùn)練組大鼠步行CPG內(nèi)多巴胺能INs計(jì)數(shù)86.20±3.27個(gè)/視野，與Sham組與損傷對(duì)照組對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。平均熒光強(qiáng)度:Sham

12、組步行CPG內(nèi)多巴胺能INs的MFI為0.0564±0.0060，損傷對(duì)照組步行CPG內(nèi)多巴胺能INs的MFI升高至0.1466±0.0296，顯著高于Sham組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，6周步行訓(xùn)練后多巴胺能INs的MFI進(jìn)一步升高至0.2134±0.0257，顯著高于損傷對(duì)照組及Sham組(P＜0.05)。
　　5.腰段谷氨酸能、去甲腎上腺素能、多巴胺能神經(jīng)元表達(dá)與BBB評(píng)分相關(guān)性
　　以三類興奮性INs的計(jì)數(shù)、M

13、FI這6個(gè)指標(biāo)作為自變量，以BBB評(píng)分作為應(yīng)變量，進(jìn)行逐步線性回歸分析（a入=0.05，a出=0.10）。經(jīng)分析，方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=107.646，P=0.000)，決定系數(shù)R2=0.931，調(diào)整R2=0.922，自變量谷氨酸能INs計(jì)數(shù)進(jìn)入方程，即為分析所得的影響B(tài)BB評(píng)分的主要因素。谷氨酸能INs計(jì)數(shù)與BBB評(píng)分呈正相關(guān)，即隨著谷氨酸能INs數(shù)量的增多，BBB評(píng)分增高。
　　6.腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板數(shù)量及表達(dá)
　　Sham

14、組大鼠腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板呈深棕色，橢圓形，形態(tài)規(guī)整，多呈弧線形排列于腓腸肌長(zhǎng)軸雙側(cè)中外1/3處。步行訓(xùn)練組大鼠腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板形態(tài)、著色程度、排列方式與Sham組類似，計(jì)數(shù)（17.6±5.1個(gè)/視野）與Sham組(16.0±4.5個(gè)/視野)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。損傷對(duì)照組大鼠腓腸肌的運(yùn)動(dòng)終板周圍為較淺的棕色，中央近乎透明，同樣呈橢圓形但面積小，呈較為松散的弧線形排列，位置與Sham組類似，計(jì)數(shù)（8.8±1.6個(gè)/視野）與Sham組

15、及步行訓(xùn)練組相比均明顯減少（P＜0.05）。通過(guò)目標(biāo)區(qū)域平均光密度對(duì)各組切片的運(yùn)動(dòng)終板著色程度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)步行訓(xùn)練組大鼠腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板著色程度(0.5642±0.0075)與Sham組(0.5872±0.0491)相似（P＞0.05），且均高于損傷對(duì)照組(0.4220±0.4050)(P＜0.05)。
　　對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)終板數(shù)量、光密度值與BBB評(píng)分進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)不同干預(yù)手段下脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)終板的數(shù)量及光密度值與BBB評(píng)分之間

16、存在顯著相關(guān)關(guān)系，即對(duì)SCI大鼠進(jìn)行步行訓(xùn)練，其后肢的運(yùn)動(dòng)功能可隨著運(yùn)動(dòng)終板數(shù)量的恢復(fù)及乙酰膽堿酯酶濃度和活性的增高而提高。
　　結(jié)論：1.步行訓(xùn)練能有效促進(jìn)SCI大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，促進(jìn)谷氨酸能、去甲腎上腺素能、多巴胺能中間神經(jīng)元表達(dá)，改善CPG代謝，提高腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板數(shù)量和表達(dá)。
　　2.脊髓谷氨酸能神經(jīng)元作為主要的興奮性中間神經(jīng)元參與CPG的步行節(jié)律形成。
　　3.步行訓(xùn)練通過(guò)增強(qiáng)谷氨酸能、去甲腎上腺素能、多