基因治療制劑的質(zhì)量控制、安全性評(píng)價(jià)及穩(wěn)定性研究.pdf

1、第一部分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立與質(zhì)量控制擬訂了《重組腺病毒Ad-HGF制造和檢定規(guī)程》及《質(zhì)粒pUDKH制造及檢定規(guī)程》，并依據(jù)<規(guī)程>要求對(duì)生物制劑重組腺病毒Ad-HGF和質(zhì)粒pUDKH進(jìn)行質(zhì)量控制，重組腺病毒Ad-HGF的檢測(cè)項(xiàng)目包括：物理檢查、最低裝量、無菌試驗(yàn)、支原體檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素含量、病毒顆粒數(shù)、病毒純度、病毒感染滴度(PFU/ml)、病毒比滴度、目的基因(HGF)表達(dá)、復(fù)制型病毒檢測(cè)、氯化銫殘留量、殘余抗生素(青霉素、鏈霉素)檢查

2、、異常毒性試驗(yàn)、牛血清白蛋白殘留量(ng/ml)、腺病毒蛋白鑒別(細(xì)胞病變法)、病毒DNA分子量、酶切圖譜、特征基因E2B區(qū)檢查等19項(xiàng)；質(zhì)粒pUDKH的檢測(cè)項(xiàng)目包括：物理檢查、無菌試驗(yàn)、支原體檢查、pH值、含量測(cè)定、純度測(cè)定、RNA殘留量、細(xì)菌基因組DNA殘留量、宿主菌蛋白殘留量、細(xì)菌內(nèi)毒素含量、限制性酶切圖譜、目的基因DNA序列、鑒別目的基因試驗(yàn)、目的基因表達(dá)活性、異常毒性試驗(yàn)、殘余TritonX-100含量測(cè)定、殘余抗生素檢查等1

3、7項(xiàng)。結(jié)果兩種制劑的質(zhì)量均符合檢定規(guī)程的要求。 第二部分質(zhì)粒pUDKH的安全性評(píng)價(jià)(1)質(zhì)粒pUDKH急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠肌肉或腹腔注射pUDKH，觀察期內(nèi)未見明顯的毒性反應(yīng)；小鼠一次肌肉注射pUDKH最大耐受量(MTD)，雌性動(dòng)物為36.6mg/kg，雄性動(dòng)物為35.6mg/kg；小鼠一次腹腔注射pUDKH最大耐受量(MTD)，雌性動(dòng)物為39.0mg/kg，雄性動(dòng)物為39.0mg/kg；小鼠注射pUDKHMTD相當(dāng)擬臨床

4、用量的120-136倍(按公斤體重計(jì)算)或10-11倍(按體表面積計(jì)算)。(2)質(zhì)粒pUDKH長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)(大鼠及Beagle犬)，大鼠肌注pUDKH劑量為0.63mg/kg和2.5mg/kg兩種，擬臨床用量的22倍和88倍，Beagle犬肌注pUDKH劑量為0.150mg/kg、0.375mg/kg和0.937mg/kg三種，分別為擬臨床用量的5.3倍、13.5倍和31.6倍，連續(xù)用藥14次，每周兩次。結(jié)果各組動(dòng)物在給藥期間及恢復(fù)期內(nèi)

5、，觀察一般藥物反應(yīng)、外周血液有形成份、血清生化、尿液生化、組織病理學(xué)檢查，均未見異常的改變。各時(shí)間點(diǎn)血清中未檢測(cè)到抗HGF抗體的存在。另外觀察了目的基因(HGF)在多種組織內(nèi)的分布，結(jié)果除了注射局部的肌肉組織檢測(cè)到HGF外，其它組織未見到有HGF的高分布，表明局部注射pUDKH后，可以做到定點(diǎn)局部表達(dá)。(3)質(zhì)粒pUDKH一般藥理試驗(yàn)，利用整體小鼠、犬以及離體豚鼠回腸試驗(yàn)，觀察了重組質(zhì)粒pUDKH的一般藥理學(xué)作用。結(jié)果表明，肌肉注射重組

6、質(zhì)粒pUDKH后，對(duì)小鼠一般行為活動(dòng)、精神狀態(tài)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，植物神經(jīng)系統(tǒng)，消化系統(tǒng)等均無明顯影響，無鎮(zhèn)痛和催眠作用。對(duì)麻醉犬血壓、心率、心電圖指標(biāo)、呼吸、體溫?zé)o明顯影響。 第三部分重組腺病毒Ad-HGF的安全性評(píng)價(jià)(1)重組腺病毒Ad-HGF的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠肌肉或腹腔注射Ad-HGF，觀察期內(nèi)未見明顯的毒性反應(yīng)。小鼠一次肌肉注射Ad-HGF最大耐受量(MTD)，雌性動(dòng)物為1.46×109PFU/kg，雄性動(dòng)物為1.

7、49×109PFU/kg；小鼠一次腹腔注射Ad-HGF最大耐受量(MTD)，雌性動(dòng)物為1.45×109PFU/kg，雄性動(dòng)物為1.50×109PFU/kg。小鼠注射Ad-HGFMTD相當(dāng)擬臨床用量的190倍(按公斤體重計(jì)算)或17.4倍(按體表面積計(jì)算)。(2)重組腺病毒Ad-HGF的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)(大鼠及Beagle犬)，2大鼠肌注Ad-HGF劑量為2×108和1×109PFU/kg兩種，擬臨床用量的26倍和130倍，Beagle犬肌注

8、Ad-HGF劑量為2.4×107pfu/kg和2.4×108pfu/kg兩種，分別為擬臨床用量的3.4倍和34倍，連續(xù)用藥14次，每周兩次。結(jié)果與上述質(zhì)粒的結(jié)果類似，未見任何不良反應(yīng)。大鼠連續(xù)肌注Ad-HGF第7次后，動(dòng)物出現(xiàn)抗腺病毒抗體，停藥后13、14周抗體消失；犬肌注Ad-HGF14次后，動(dòng)物開始出現(xiàn)抗腺病毒抗體，停藥后12周抗腺病毒抗體消失。各時(shí)間點(diǎn)血清中未檢測(cè)到抗HGF抗體的存在，且目的基因(HGF)定點(diǎn)局部表達(dá)。 第

9、四部分重組腺病毒Ad-HGF的穩(wěn)定性研究探討不同溫度對(duì)重組腺病毒Ad-HGF保存時(shí)間的影響。以含10％甘油的Hank's液保存Ad-HGF(攜帶人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因)、Ad-GFP(攜帶綠色熒光蛋白基因)，用快速細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)方法、ELISA方法、流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)在不同溫度(-60℃、-20℃、4℃、25℃和37℃)、不同時(shí)間保存的重組腺病毒對(duì)其感染滴度、目的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率的影響。結(jié)果-60℃保存最長(zhǎng)時(shí)間44個(gè)月，其轉(zhuǎn)