可注射水凝膠攜帶Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC移植治療大鼠心肌梗死及其機(jī)制研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)移植治療心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)極有發(fā)展前景，但臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示治療效果微弱，移植細(xì)胞在缺血心肌極低的滯留率和存活率是主要原因之一。對(duì)MSC進(jìn)行基因修飾或使用生物材料來(lái)承載后移植可改善這一問題。Bcl-2(B-cell lymphoma2，Bcl-2)基因能抑制細(xì)胞凋亡。VEGF(Vascular Endothelial Growt

2、h Factor，VEGF)基因能促血管生成。可注射水凝膠(Injectable Hydrogel，IH)具有可注射性、生物降解性和組織細(xì)胞相容性，能承載細(xì)胞進(jìn)行移植。
　　目的:
　　使用IH聯(lián)合Bcl-2和VEGF雙基因修飾擬提高M(jìn)SC移植對(duì)MI的療效，為臨床使用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。
　　方法和結(jié)果:
　　1、PCR擴(kuò)增獲取Bcl-2和VEGF基因并使用T2A序列連接以實(shí)現(xiàn)雙基因的共表達(dá)。構(gòu)建能同時(shí)攜帶B

3、cl-2和VEGF基因的慢病毒載體并篩選構(gòu)建能穩(wěn)定過表達(dá)Bcl-2和VEGF基因的SD大鼠MSC。熒光定量PCR和Western blot結(jié)果證實(shí)Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC對(duì)比Bcl-2或VEGF單基因表達(dá)MSC對(duì)Bcl-2和VEGF基因有更高的表達(dá)。CCK-8結(jié)果說(shuō)明Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC對(duì)比Bcl-2或VEGF單基因表達(dá)MSC增殖更快。
　　2、體外糖氧剝奪（Oxygen and Glucose D

4、eprivation，OGD）模型模擬體內(nèi)缺血缺氧微環(huán)境，實(shí)驗(yàn)分為五組:MSC-GFP組、MSC-VEGF組、MSC-Bcl-2組、MSC-BV組、MSC-GFP正常培養(yǎng)組。AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)和Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3，結(jié)果表明OGD誘發(fā)了MSC的凋亡，Bcl-2或VEGF單基因修飾的MSC凋亡減少，Bcl-2和VEGF雙基因修飾的MSC-BV較

5、Bcl-2或VEGF單基因修飾的MSC凋亡減少更顯著。ELISA結(jié)果顯示Bcl-2和VEGF雙基因修飾能增強(qiáng)OGD環(huán)境下MSC旁分泌VEGF，bFGF，HGF和IGF-1。
　　3、IH攜帶Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC進(jìn)行對(duì)MI大鼠的移植治療，實(shí)驗(yàn)分為六組:SHAM組、PBS組、IH組、MSC組、MSC+BV組、MSC+BV+IH組。細(xì)胞移植治療4周后心臟超聲結(jié)果提示MSC+BV+IH組的心臟收縮功能改善更顯著。HE和M

6、asson染色結(jié)果提示MSC+BV+IH組的梗死面積顯著縮小。cTnT免疫熒光結(jié)果提示MSC+BV+IH組心肌存活更多。TUNEL和Western blot結(jié)果提示MSC+BV+IH組心肌細(xì)胞凋亡減少更顯著。vWF和a-SMA免疫熒光結(jié)果提示MSC+BV+IH組血管密度更高。CM-Dil標(biāo)記MSC移植提示MSC+BV+IH組的細(xì)胞滯留改善更明顯。
　　4、原代培養(yǎng)SD乳鼠心肌細(xì)胞，與MSC使用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)置于1％O

7、2缺氧處理24h，實(shí)驗(yàn)分為四組:心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)組、心肌細(xì)胞缺氧組、心肌細(xì)胞+MSC+GFP缺氧組、心肌細(xì)胞+MSC+BV缺氧組。采用AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)、Western blot檢測(cè)凋亡蛋白Cleaved-capase-3、TUNEL分析心肌細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明與Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC共培養(yǎng)更能減少缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)

8、重組慢病毒載體;篩選構(gòu)建了Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC;對(duì)比Bcl-2或VEGF單基因表達(dá)MSC，其對(duì)目的基因Bcl-2和VEGF有更高的表達(dá)，更快的增殖速度。
　　2、Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC對(duì)比Bcl-2或VEGF單基因表達(dá)MSC在體外糖氧剝奪環(huán)境下發(fā)揮更好的自我保護(hù)和旁分泌作用。
　　3、Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC移植對(duì)心肌梗死有更好的治療作用，可注射水凝膠的承載移植進(jìn)一步增強(qiáng)了MS