PGC-1α過表達對PD模型細胞的線粒體和在體多巴胺能神經元的影響.pdf

1、帕金森病(PD)是以黑質多巴胺(DA)能神經元變形死亡為病理特征的一種神經退行性疾病，發(fā)病年齡平均為60歲。臨床表現為肌強直、靜止性震顫、步態(tài)和姿勢不穩(wěn)等運動障礙，以及失眠、抑郁等非運動癥狀，會嚴重影響老年人的健康。引發(fā)該病的因素包括遺傳、環(huán)境、藥物等，由這些因素導致的線粒體功能障礙、氧化應激、蛋白質聚集、炎癥反應等是主要機制，其中線粒體功能障礙可能是重要的機制之一。線粒體是細胞的能量供給中心，同時也是生成氧自由基(ROS)的主要場所，

2、上述因素都可能使線粒體的電子傳遞鏈功能異常而生成ROS增加。ROS對細胞產生氧化應激損傷，使DA能神經元變形死亡而引發(fā)PD。有實驗證明，自噬-溶酶體系統(tǒng)與PD的發(fā)病有關，尤其與線粒體自噬密切相關。近年來發(fā)現，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α（PGC-1α）在劇烈運動時會高表達，并與線粒體的生物發(fā)生和細胞自噬/線粒體自噬密切相關，使其在骨骼肌細胞的重塑過程中起著重要作用。這提示，PGC-1α可能通過調節(jié)線粒體的自噬和生物發(fā)生

3、而對細胞的損傷有保護作用。那么，如果人為提高PGC-1α的表達，能否對MPP+損傷的DA能神經元進行保護？其對細胞自噬/線粒體自噬有否影響？對在體DA能神經元的損傷有否保護作用？對膠質細胞和炎癥反應有否影響？這些都是非常值得探討的問題。對這些問題的解明將有助于確定PGC-1α能否作為防治PD的藥物靶點提供必要的實驗證據，具有一定的理論和實際意義。
　　針對上述問題，本研究擬以SH-SY5Y細胞和C57BL/6小鼠為研究對象，用MP

4、P+誘導SH-SY5Y細胞損傷復制PD細胞模型，通過腹腔注射MPTP復制C57BL/6小鼠的PD模型。首先采用MTT比色法、FJC染色法、Hoechst33342染色法來確定MPP+對SH-SY5Y細胞的最佳損傷條件;將細胞和動物均分為CON組、MPP+(MPTP)組、NCOE+MPP+(MPTP)組和OE+MPP+(MPTP)組;在OE+MPP+(MPTP)組，用構建好的PGC-1α過表達慢病毒對SH-SY5Y細胞和小鼠中腦黑質進行轉

5、染使其過表達;通過MTT比色法檢測以上四組SH-SY5Y細胞的存活率的變化，然后采用Real-time PCR來探究PGC-1α過表達后線粒體相關基因和自噬相關基因mRNA水平的變化;用免疫熒光染色法來觀察中腦黑質多巴胺能神經元以及星形膠質細胞和小膠質細胞的表達變化，從而為上述問題尋找答案。
　　實驗所得結果如下:
　　1.當MPP+的濃度為1 mmol/L，對細胞作用時間為24 h時，細胞存活率接近50％，所以MPP+的使

6、用濃度1 mmol/L作用24 h為MPP+損傷的最適建模條件。
　　2.通過FJC染色法、Hoechst33342染色法檢測MPP+對SH-SY5Y細胞不同時間點的損傷發(fā)現，隨著與MPP+孵育時間的增加，細胞的凋亡率逐漸增加，說明MPP+損傷與孵育時間成正相關，由以上兩個實驗結果綜合考慮MPP+的損傷時間為24 h，濃度為1mmol/L。
　　3.利用PCR技術獲取目的基因后與線性載體進行連接，轉化，對陽性轉化子進行PCR

7、鑒定，測序后與目的基因進行比對得出重組質粒的測序結果和目標序列一致，獲得過表達載體。
　　4.ELISA法滴度檢測NCOE和OE病毒的滴度分別為1×109 TU/ml和2×108 TU/ml。
　　5.通過MTT比色法測定PGC-1α過表達后細胞存活率，發(fā)現PGC-1α過表達后，細胞的存活率明顯上升。NCOE組較正常組無顯著性差異。OE組細胞的存活率較各組均有明顯升高的趨勢，且與MPP+組和NCOE組比具有極顯著的差異(P＜

8、0.01)，和CON組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。
　　6.Real-time PCR檢測線粒體相關基因(NRF1、Drp1、Mfn2)、自噬相關基因(LC3B、p62)的表達變化。發(fā)現PGC-1α過表達后，NRF1 mRNA的表達也顯著升高，且與MPP+組和NCOE組比較均有極顯著差異(P＜0.01)。而線粒體分裂、融合基因Drp1和Mfn2的mRNA表達也明顯升高。OE組Drp1較MPP+組具有極顯著差異(P＜0.01

9、)與NCOE組相比無統(tǒng)計學差異。Mfn2 mRNA的表達較MPP+組和NCOE組比較均有極顯著差異(P＜0.01)。自噬相關基因LC3B的mRNA表達明顯降低，且與MPP+組和NCOE組比較均有極顯著差異(P＜0.01)。p62 mRNA的表達明顯升高，且與MPP+組和NCOE組比較均有極顯著差異(P＜0.01)。
　　7.對小鼠進行黑質立體定位注射PGC-1α過表達慢病毒基因干預后，統(tǒng)計結果表明，小鼠中腦黑質致密部多巴胺能神經元

10、的數量沒有明顯的改善，TH陽性神經元的表達各組之間無統(tǒng)計差異。免疫熒光檢測PGC-1α的表達變化發(fā)現OE組PGC-1α陽性細胞數較MPTP組和NCOE組均有明顯增多的趨勢，且具有極顯著差異(P＜0.01)。尤其是在黑質的致密部，PGC-1α陽性細胞數明顯增多。雖然在細胞數上PGC-1α的表達是升高的，但是，由免疫熒光圖片我們可觀察到PGC-1α形態(tài)較為異常，細胞變得不規(guī)則。此外，免疫熒光統(tǒng)計結果也顯示了，小膠質細胞和星形膠質細胞出現了過

11、度激增的現象。
　　通過對上述實驗結果的分析，得出如下結論:
　　1.本研究檢測所得1 mmol/L的MPP+對SH-SY5Y細胞損傷24 h為MPP+的最適建模條件。可成功復制出MPP+誘導的PD體外模型。
　　2.PD細胞模型中，過表達PGC-1α可以抵抗MPP+誘導的細胞毒性，抑制自噬的發(fā)生，增加MPP+損傷后NRF1的表達，提高線粒體融合基因Mfn2的表達對于改善線粒體功能，維護線粒體分裂融合的動態(tài)平衡起到了一