靶向ftsZ基因反義肽肽核酸抑制耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的實驗研究.pdf

1、第一部分計算機輔助軟件設計聯(lián)合體外斑點雜交篩選靶向ftsZ基因反義寡核苷酸序列
　　目的:采用計算機輔助軟件設計聯(lián)合體外斑點雜交篩選能與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ftsZ基因mRNA緊密結合的高效反義寡核苷酸序列。
　　方法：利用計算機輔助軟件（RNA Structure5.0）對ftsZ mRNA進行二級結構分析計算，并進行自由能計算，在膨脹環(huán)，發(fā)卡等不穩(wěn)定的結構區(qū)域設計10條反義寡核苷酸序列，另設計一條與ftsZ基因上的一

2、段堿基序列完全相同的寡核苷酸序列作為陰性對照，合成反義探針，和體外轉錄并且用地高辛標記的ftsZ mRNA進行斑點雜交，根據(jù)信號的強弱，篩選出高效的反義寡核苷酸序列。
　　結果：體外斑點雜交實驗結果顯示，計算機軟件設計的11條反義寡核苷酸序列中，其中有6條顯示不同程度的雜交信號，1條正義序列未顯示任何信號。
　　結論：計算機輔助軟件聯(lián)合體外斑點雜交能夠減少反義核酸設計的盲目性，為體外可靠、快速、高通量篩選高效反義寡核苷酸序列

3、提供了一種有效的方法，并且為篩選所有基因高效反義序列搭建了一個平臺。
　　第二部分靶向ftsZ基因反義肽肽核酸體外抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長
　　目的：研究以 fstZ基因為靶基因的反義肽核酸（peptide nucleic acid， PNA）對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（ methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA） fstZ基因表達的抑制作用和體外抗菌活性，探

4、討其作為新型抗菌藥物制潛在應用價值。
　　方法：在本實驗研究中，根據(jù)第一部分篩選出的能與 ftsZ基因高效緊密結合的反義寡核苷酸序列，合成肽核酸PNA1，同時，在ftsZ基因起始區(qū)域設計一條反義寡核苷酸序列，包括起始密碼子AUG和SD序列，合成肽核酸PNA2，在PNA1的基礎上設計一條有3個堿基錯配的PNA1作為陰性對照，三條肽核酸分別與穿膜肽序列(RXR)4XB連接形成PPNA。分別用不同濃度的PPNA處理MRSA CY-11菌

5、株，37°C5％CO2培養(yǎng)不同時間后測定細菌光密度值OD600并每隔兩小時做平板菌落計數(shù)，觀察其對細菌的生長抑制作用，采用逆轉錄PCR檢測ftsZ基因mRNA表達水平觀察其對靶基因表達的抑制作用。
　　結果：PPNA1，PPNA2均具有明顯的靶基因抑制作用和體外抗菌活性，并呈時間和濃度依賴性，其最低抑菌濃度分別為30μmol/L和40μmol/L，PPNA1在劑量為40μmol/L具有殺菌活性，而具有3個錯配堿基的 Scr PPN