桂皮醛抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)生物膜形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:分別通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究證明桂皮醛(cinnamaldehyde,CA)對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)形成生物膜的抑制作用；并檢測(cè)桂皮醛對(duì)MRSA生物膜形成關(guān)鍵基因sarA以及體內(nèi)試驗(yàn)動(dòng)物血清中炎癥因子IL-1β的影響,為進(jìn)一步探討桂皮醛的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.將實(shí)驗(yàn)菌株(包括6株MRSA和1株標(biāo)

2、準(zhǔn)菌株ATCC25923)接種L-B瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24h,然后行K-B法和微量瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn),測(cè)得抑菌環(huán)直徑,最低抑菌濃度(minimum inhibitoryconcentration,MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidalconcentration,MBC)；
　　 2.利用96孔板法構(gòu)建MRSA生物膜,分別加入不同濃度的藥物(包括0.5×,1×,2.5×和5×MIC),作用24h后分別采

3、用MTT法和菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定生物膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的變化；
　　 3.分別采用掃描電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡對(duì)上述桂皮醛對(duì)MRSA生物膜的作用加以驗(yàn)證；
　　 4.利用PCR方法檢測(cè)各待測(cè)菌株內(nèi)有無(wú)icaA和sarA兩種基因；
　　 5.不同濃度的桂皮醛作用MRSA生物膜24h后,提取細(xì)菌細(xì)胞總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)用藥前后sarAmRNA水平的變化；
　　 6.在體內(nèi),采用皮下羧甲

4、基纖維素鈉(CMC)-囊袋法制備MRSA在SD大鼠體內(nèi)的生物膜模型,并給模型大鼠分別連續(xù)腹腔注射桂皮醛(cinnamaldehyde,CA)30、45、60(mg／(kg.d))4d,同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組和生物膜模型組；
　　 7.在給藥后的第1d、3d、5d采集菌液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),末次給藥后24h斷頭取血,收集病變組織,進(jìn)行病理切片觀察；用RT-PCR檢測(cè)血中IL-1βmRNA的變化；用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清中IL-1β含量的變化。

5、
　　 結(jié)果:
　　 1.從K-B法藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出:抑菌環(huán)直徑隨加藥濃度的增大而增大。當(dāng)加藥濃度為4％(v／v)時(shí),各測(cè)試菌株的抑菌環(huán)直徑均≥26mm,達(dá)到了藥敏試驗(yàn)敏感的范圍；微量瓊脂稀釋法測(cè)得各待測(cè)菌株的MIC和MBC值的范圍分別為0.0625％-0.125％(v／v)和0.25％-0.5％(v／v)；
　　 2.96孔板法成功制備MRSA生物膜；加入不同濃度藥物后,MTT法和菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得的結(jié)果一致,

6、即隨加藥濃度的增大,生物膜內(nèi)菌落數(shù)量減少；
　　 3.掃描電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下分別觀察到桂皮醛對(duì)MRSA形成生物膜的破壞作用,且隨加藥濃度的增大,生物膜結(jié)構(gòu)破壞越大,膜內(nèi)菌落數(shù)越少；
　　 4.PCR結(jié)果顯示各測(cè)試菌株均無(wú)icaA基因,而含有sara基因；
　　 5.除菌株JB-06外,其他測(cè)試菌株在加入0.5×MIC濃度桂皮醛藥液后sarA基因mRNA水平降低；
　　 6.SD大鼠皮下注入金黃

7、色葡萄球菌菌液4天后形成皮下CMC-囊袋生物膜模型；
　　 7.SD大鼠腹腔注射不同濃度桂皮醛藥液后1d,3d和5d分別進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)菌落數(shù)減少；病理組織切片觀察到炎癥隨加藥時(shí)間延長(zhǎng)有愈合傾向；血中IL-1βmRNA水平在加藥后減低,ELISA法測(cè)得血中IL-1β含量隨加藥濃度增大而減少。
　　 結(jié)論:
　　 本研究通過(guò)體外和體內(nèi)試驗(yàn)分別證實(shí)了桂皮醛對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌形成生物膜的抑制作用；并