基于NGF緩釋的pH敏感可注射水凝膠的制備及其評價.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷是臨床上的一種常見疾病。目前研究的重點是采用神經(jīng)導(dǎo)管(Nerve conduits,NCs)來修復(fù)受損神經(jīng)。然而中空神經(jīng)導(dǎo)管往往由于缺乏生物活性物質(zhì)等“微環(huán)境”物質(zhì)的支持，取得的修復(fù)效果非常有限。
　　本論文為制得中空神經(jīng)導(dǎo)管的填充材料，改善神經(jīng)再生的“微環(huán)境”，從“仿生”的設(shè)計思路出發(fā)，選擇類細(xì)胞外基質(zhì)成分殼聚糖(Chitosan,CS)和細(xì)胞外基質(zhì)成分透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)，利用HA上的-

2、COOH與CS上的-NH2之間發(fā)生的酰胺交聯(lián)反應(yīng)，制備出一種響應(yīng)生理pH完成凝膠化的CS-HA可注射水凝膠，并對其進(jìn)行了表征。通過原位載藥的方式將神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor,NGF)在凝膠的制備過程中載入，獲得了CS-HA/NGF水凝膠，研究了其體外釋放性能和細(xì)胞相容性。最后將制備的CS-HA/NGF水凝膠通過注射填充于聚乳酸/β-磷酸三鈣(PDLLA/β-TCP)中空神經(jīng)導(dǎo)管中，制備了含有水凝膠的復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管

3、材料，進(jìn)行了大鼠坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)的體內(nèi)動物實驗。
　　采用試管倒置法表征了CS-HA可注射水凝膠的凝膠化時間、利用傅立葉變換紅外光譜儀(FTIR)和掃描電子顯微鏡(SEM)表征了其結(jié)構(gòu)和形貌、采用微機(jī)控制電液伺服萬能試驗機(jī)表征了其力學(xué)性能、通過稱重法考察了其溶脹和降解性能。結(jié)果顯示：在生理pH的作用下，通過改變水凝膠的組成，可使水凝膠在50s到6min內(nèi)完成凝膠化過程，能夠較好地滿足注射的需要；水凝膠的內(nèi)部為連續(xù)的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔

4、徑可控，多孔隙的結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的生長以及NGF的粘附；力學(xué)性能測試表明其壓縮模量較好；水凝膠在pH值為2.0-9.0的緩沖溶液中具有明顯的pH敏感性，有利于藥物的緩慢釋放；在8周內(nèi)的降解失重率可達(dá)到70％以上，具有較好的降解性能，有利于周圍神經(jīng)的再生。
　　以牛血清蛋白為模型藥物，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法優(yōu)化了CS-HA可注射水凝膠的處方工藝，并用該處方制備CS-HA/NGF可注射水凝膠，采用酶聯(lián)免疫吸附法對NGF的釋放性能進(jìn)行

5、了研究。結(jié)果顯示：當(dāng)CS和HA的質(zhì)量比接近3:1時，水凝膠的累計釋放量最高，NGF的釋放周期為28天左右，累積釋放率約為79.47%，CS-HA/NGF水凝膠可實現(xiàn)NGF的持續(xù)緩慢釋放，有望為周圍神經(jīng)修復(fù)提供良好的微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)再生。
　　將RSC96大鼠雪旺細(xì)胞(RSC96)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)、腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)與CS-HA/NGF水凝膠共培養(yǎng)，采用CCK-8法評價了水凝膠的細(xì)胞毒性，采用細(xì)胞免疫

6、熒光染色法以及掃描電鏡圖評價了細(xì)胞在材料表面的粘附和增殖情況，采用PC12細(xì)胞增殖法評價了水凝膠對NGF活性的保護(hù)作用。結(jié)果顯示：CS-HA/NGF水凝膠無細(xì)胞毒性并且有利于RSC96細(xì)胞和BMMSCs細(xì)胞的粘附和生長，CS-HA/NGF水凝膠在1、7、14、21天的緩釋液都可以在一定程度上促進(jìn)PC12細(xì)胞的軸突分化，說明該水凝膠可以較長時間地維持NGF的活性。
　　以PDLLA/β-TCP中空神經(jīng)導(dǎo)管、復(fù)合CS-HA水凝膠以及復(fù)

7、合CS-HA/NGF水凝膠的PDLLA/β-TCP神經(jīng)導(dǎo)管、自體神經(jīng)進(jìn)行了大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損的修復(fù)實驗，主要考察了大鼠術(shù)后1個月和3個月的再生神經(jīng)以及腓腸肌的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)。結(jié)果顯示：含有CS-HA/NGF水凝膠的神經(jīng)導(dǎo)管組對大鼠坐骨神經(jīng)的修復(fù)效果顯著優(yōu)于中空神經(jīng)導(dǎo)管組，且和自體神經(jīng)移植組相近，可有效促進(jìn)缺損周圍神經(jīng)的再生。
　　研究結(jié)果表明，CS-HA/NGF可注射水凝膠可有效促進(jìn)神經(jīng)再生，在神經(jīng)組織工程領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用