MARVELD1影響肺癌細(xì)胞基本生物學(xué)特征的分子機(jī)制.pdf

1、腫瘤細(xì)胞具有多種特性，而惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征是細(xì)胞無(wú)限制的增殖和腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，后者是腫瘤患者重要的死亡原因之一。目前肺癌的發(fā)病率和死亡率已居首位，且嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。盡管臨床診斷和治療技術(shù)不斷發(fā)展，但患者的5年生存率長(zhǎng)期徘徊在30％左右，深入研究其發(fā)生及發(fā)展的分子機(jī)制，將為臨床治療提供新的理論基礎(chǔ)，有助于改進(jìn)肺癌治療的有效性。
　　MARVELD1是本課題組發(fā)現(xiàn)的一個(gè)侯選的腫瘤抑制基因，其在在乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤組織

2、中表達(dá)顯著下調(diào)，但深入的作用機(jī)制尚不明確。因此，本論文采用組織芯片、細(xì)胞周期同步化、RNA-seq高通量檢測(cè)、表達(dá)調(diào)控分析等技術(shù)對(duì)MARVELD1在肺癌中的作用及其分子基礎(chǔ)開(kāi)展了深入的研究。
　　研究中首先利用組織芯片免疫組化染色分析MARVELD1在肺癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MARVELD1在多種組織類(lèi)型的肺癌中表達(dá)明顯下調(diào)。分析MARVELD1與肺癌病例特征的關(guān)系，證實(shí)MARVELD1與TNM分期顯著負(fù)相關(guān)，與生存期顯著正相關(guān)。免疫印

3、跡技術(shù)分析MARVELD1在多種不同病理分型的肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，證實(shí)了在肺癌細(xì)胞中MARVELD1表達(dá)的下調(diào)。研究進(jìn)一步利用亞硫酸鹽甲基化測(cè)序分析技術(shù)，揭示了MARVLED1在肺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)制。
　　鑒于惡性增殖是腫瘤的最基本生物學(xué)特性，結(jié)合MARVELD1在肺癌組織細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的特點(diǎn)，研究進(jìn)一步分析其對(duì)肺癌細(xì)胞增殖抑制的能力。分析發(fā)現(xiàn)MARVELD1能夠抑制A549細(xì)胞的體外增殖，抑制細(xì)胞周期并阻滯在G1期。

4、通過(guò)周期同步化技術(shù)分析MARVELD1的表達(dá)與周期進(jìn)程的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MARVELD1表達(dá)伴隨著細(xì)胞周期進(jìn)程而增加，其在S期表達(dá)較低，G2/M期表達(dá)較高。周期同步化和免疫共沉淀技術(shù)分析還表明MARVELD1能夠與H4K20me1特異性結(jié)合，且調(diào)控細(xì)胞周期G1期進(jìn)程。分析MARVELD1調(diào)控細(xì)胞周期G1期進(jìn)程的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)MARVELD1與p53啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，正調(diào)控P53的表達(dá)，引發(fā)了CyclinD1的表達(dá)下調(diào)，從而抑制細(xì)胞周期從G1期向S

5、期的進(jìn)程。
　　轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤另一主要基本生物學(xué)特征，也是最重要的特性。為探討MARVELD1對(duì)肺癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的影響，本研究首先通過(guò)掃描電鏡和原子力顯微鏡觀察了MARVELD1對(duì)細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)及力學(xué)特性的影響，發(fā)現(xiàn)MARVELD1能夠增加細(xì)胞表面微絨毛的長(zhǎng)度及形態(tài)特征，增加細(xì)胞的楊氏模量。進(jìn)一步利用RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù)分析MARVELD1表達(dá)對(duì)全基因組的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)MARVELD1可負(fù)調(diào)控整聯(lián)蛋白β1和正調(diào)控整聯(lián)蛋白β

6、4的表達(dá)。為此，研究通過(guò)ChIP、熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)及RNA-IP技術(shù)分析了MARVELD1調(diào)控其表達(dá)的分子機(jī)制，由此揭示MARVELD1影響整聯(lián)蛋白β1和β4在微絨毛尾部的定位。采用細(xì)胞鋪展實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕愈傷和侵襲小室技術(shù)分析，證實(shí)MARVELD1具有通過(guò)下調(diào)整聯(lián)蛋白β1的表達(dá)抑制細(xì)胞遷移，通過(guò)上調(diào)整聯(lián)蛋白β4表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞與基底的粘附的雙重功能。
　　在以上研究基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步探討了MARVELD1對(duì)肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（E

7、pithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響，形態(tài)學(xué)研究結(jié)果表明，MARVELD1具有維持細(xì)胞上皮樣形態(tài)的能力。實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡等試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)MARVELD1能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。其抑制EMT的分子機(jī)制為MARVELD1能夠通過(guò)調(diào)控整聯(lián)蛋白β1/β4的表達(dá)平衡抑制TGF-β1誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　綜上所述，本文通過(guò)對(duì)MARVELD1在肺癌中的表達(dá)模式分析及對(duì)細(xì)胞