MARVELD1調(diào)控粘附相關(guān)基因mRNA加工和NMD機(jī)制的研究.pdf

1、細(xì)胞的無限增殖以及向周圍組織侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的兩大重要的生物學(xué)特征，也是腫瘤致死率居高不下的關(guān)鍵原因。細(xì)胞的侵襲運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)是腫瘤擴(kuò)散的直接原因。多年來，研究者致力于揭示調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制，但是到目前為止還遠(yuǎn)未完全闡明。
　　MARVELD1基因是本研究室在前期工作中獲得的一個(gè)功能未知的新基因，全基因表達(dá)譜分析的結(jié)果顯示：MARVELD1主要影響了mRNA加工通路和粘著斑信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)還對(duì)MAPK細(xì)胞增

2、殖通路的部分基因的表達(dá)有一定的影響。在前期工作中，MARVELD1對(duì)多種腫瘤細(xì)胞（尤其是肝癌細(xì)胞）增殖的影響均已得到了證實(shí)。此外，在前期的相互作用蛋白篩選中，研究發(fā)現(xiàn)MARVELD1與importinβ1存在相互作用。importinβ1是一類經(jīng)典的介導(dǎo)核質(zhì)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵蛋白，參與了多種分子生物學(xué)通路，包括RNA的5′帽子結(jié)合蛋白CBP80和CBP20的核質(zhì)循環(huán)、無義介導(dǎo)的RNA降解機(jī)制（NMD）等。NMD是一種RNA質(zhì)量監(jiān)控機(jī)制，大量研究

3、表明，mRNA加工可能會(huì)激發(fā) NMD通路活性。因此，本課題主要致力于解析MARVELD1與細(xì)胞黏附及相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞鋪展和遷移運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞粘附相關(guān)基因表達(dá)及其mRNA加工通路以及NMD機(jī)制的相關(guān)性。
　　細(xì)胞鋪展是細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵一步，而細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附力是細(xì)胞鋪展過程的基本驅(qū)動(dòng)力之一。首先，本研究分析了MARVELD1對(duì)A549、H520以及NIH3T3細(xì)胞鋪展過程的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MARVELD1負(fù)調(diào)控了以上細(xì)胞的鋪展

4、速率和面積。進(jìn)一步的細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MARVELD1負(fù)調(diào)控A549和H520細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分Collagen I以及Laminin V之間的粘附作用。在此基礎(chǔ)上，通過劃痕實(shí)驗(yàn)分析了MARVELD1對(duì)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的影響，結(jié)果顯示MARVELD1正調(diào)控了人肺癌細(xì)胞A549和H520的遷移能力。
　　細(xì)胞粘附是細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)的重要驅(qū)動(dòng)力。為進(jìn)一步研究MARVELD1影響細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)了MARVELD1對(duì)細(xì)胞粘附

5、相關(guān)基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)MARVELD1主要調(diào)控了FAK第397位酪氨酸的磷酸化水平以及integrinβ4、paxillin和integrinβ1的蛋白表達(dá)。結(jié)合前期的全基因表達(dá)譜分析結(jié)果，本研究重點(diǎn)分析了MARVELD1對(duì)以上三個(gè)基因的pre-mRNA和mRNA的相對(duì)含量的影響，發(fā)現(xiàn)MARVELD1可能主要調(diào)控integrinβ1基因的mRNA加工過程。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，MARVELD1定位于RNA加工主要場(chǎng)所speckle小體，并

6、與RNA的5′帽子結(jié)合蛋白CBP20存在相互作用。由于RNA加工過程與NMD機(jī)制相偶聯(lián)，而且 CBP20是參與NMD機(jī)制的重要因子，所以該結(jié)果提示：MARVELD1可能也參與了NMD通路。
　　為明確 MARVELD1與NMD通路的相關(guān)性，本研究分析了MARVELD1對(duì)NMD報(bào)告基因和已知的內(nèi)源靶轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示MARVELD1顯著提高它們的穩(wěn)定性，因此也證實(shí)MARVELD1抑制了NMD通路活性。在研究其分子機(jī)制中，

7、發(fā)現(xiàn)MARVELD1與重要的NMD因子UPF1和Y14存在相互作用，而且確定了MARVELD1與UPF1相互作用的關(guān)鍵氨基酸區(qū)域。MARVELD1抑制了UPF1與SMG1的相互作用，卻促進(jìn)了UPF1與importinβ1相結(jié)合。由于SMG1是UPF1的磷酸化激酶，所以本研究進(jìn)一步探討了UPF1的磷酸化水平，結(jié)果顯示MARVELD1抑制了UPF1的絲氨酸磷酸化水平，阻斷了后續(xù)SMG5與UPF1的相互作用。因此，綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，MARVE

8、LD1通過與UPF1相互作用抑制其絲氨酸磷酸化，阻斷后續(xù)的SMG5介導(dǎo)的RNA降解進(jìn)程，進(jìn)而抑制NMD通路活性。
　　綜上所述，本研究證實(shí)MARVELD1負(fù)調(diào)控了人肺癌細(xì)胞A549和H520的鋪展及粘附能力，正調(diào)控了二者的遷移運(yùn)動(dòng)能力；影響了多種細(xì)胞粘附相關(guān)蛋白integrinβ1、integrinβ4、α-actinin、vinculin、paxillin、moesin、p-FAK（Y397）等的表達(dá)，對(duì)于integrinβ1基