SCN1A基因截短突變患者的臨床分析及截短突變誘導(dǎo)的NMD機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究選取Dravet綜合征（DS）患者SCN1A基因不同位置的截短突變位點(diǎn)，分析相應(yīng)患者的臨床特點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建相關(guān)minigene，進(jìn)行無(wú)意義密碼子介導(dǎo)的mRNA降解(NMD)機(jī)制研究，以探討在SCN1A基因上不同位置的截短突變能否激發(fā)NMD機(jī)制，以及研究NMD與臨床表型的關(guān)系。
　　研究方法：
　　通過(guò)詳細(xì)收集攜帶SCN1A基因截短突變的Dravet綜合征（DS）患者的臨床資料及突變特點(diǎn)，構(gòu)建融合表達(dá)

2、綠色熒光蛋白（GFP）和SCN1A基因截短突變的minigene。通過(guò)鑒定不同細(xì)胞系內(nèi)源性抗性基因 Kana基因的表達(dá)，從而選取無(wú) Kana基因表達(dá)的人宮頸癌細(xì)胞（Hela細(xì)胞）、人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤株細(xì)胞（SH-SY5Y細(xì)胞）、NGF誘導(dǎo)的褐家鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞）作為轉(zhuǎn)染對(duì)象，通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染技術(shù)，將野生型質(zhì)粒及截短突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入上述三種細(xì)胞，提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得cDNA，以cDNA為模板，Kana基

3、因及GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR（QPCR）。比較SCN1A基因的野生型及截短突變型質(zhì)粒在三種細(xì)胞中的mRNA相對(duì)表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次獲得均值。相對(duì)定量數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct法，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示，采用SPSS l7.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素多樣本均數(shù)比較采用ANOVA分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1．臨床資料分析
　　攜帶 c.4526delA，c

4、.4547C>A，c.5280_5281delTG， c.5621_5622delGG截短突變位點(diǎn)的患者均診斷為SMEI，攜帶c.5540-5541insCCAG突變位點(diǎn)的患者診斷為 SMEB，無(wú)肌陣攣發(fā)作類型，其中攜帶 c.5540-5541insCCAG， c.5621_5622delGG的患者符合孤獨(dú)癥診斷，c.5540-5541insCCAG患者孤獨(dú)癥兒童行為量表(簡(jiǎn)稱ABC量表)78分，兒童孤獨(dú)癥評(píng)定量表（簡(jiǎn)稱CARS量表）3

5、6分，c.5621_5622delGG患者ABC量表110分，CARS量表41分。
　　2．PEGFP-C2-SCN1A–minigene野生型及突變型質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定
　　將表達(dá)綠色熒光蛋白及SCN1A基因24至26號(hào)外顯子的DNA片段（包含25號(hào)內(nèi)含子）連接到PEGFP-C2載體。PEGFP-C2-SCN1A-minigene質(zhì)粒測(cè)序24至26號(hào)外顯子基因編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變，得到野生型 minigene，并構(gòu)建c.4526d

6、elA，c.4547C>A，c.5280_5281delTG，c.5540-5541insCCAG，c.5621_5622delGG突變型minigene。
　　3.四種細(xì)胞系內(nèi)源性Kana基因表達(dá)鑒定
　　HEK293細(xì)胞有內(nèi)源性Kana基因表達(dá)，而NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞,Hela細(xì)胞,SH-SY5Y細(xì)胞均無(wú)內(nèi)源Kana基因表達(dá)。
　　4.熒光定量PCR
　　以Kana基因作為內(nèi)參基因，Hela細(xì)胞中野生型與

7、突變型c.4526delA，c.4547C>A， c.5280_5281delTG， c.5540-5541insCCAG， c.5621_5622delGG SCN1A基因 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.034±0.337，0.843±0.059（p>0.05），0.898±0.063（p>0.05），1.001±0.184（p>0.05），0.804±0.149（p>0.05），0.784±0.041（p>0.05）；SH-SY5Y細(xì)

8、胞中野生型與突變型 c.4526delA， c.4547C>A， c.5280_5281delTG，c.5540-5541insCCAG，c.5621_5622delGG SCN1A基因mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.001±0.073，1.046±0.045（p>0.05），1.078±0.01（p>0.05），1.057±0.037（p>0.05），1.051±0.029（p>0.05），1.204±0.088（p>0.05）；NGF誘

9、導(dǎo)的PC12細(xì)胞中野生型與突變型c.4526delA，c.4547C>A，c.5280_5281delTG， c.5540-5541insCCAG， c.5621_5622delGG SCN1A基因mRNA相對(duì)表達(dá)量分別1.01±0.174，0.67±0.118（p<0.05），0.665±0.067（p<0.05），0.684±0.102（p<0.05），0.934±0.046（p>0.05），0.634±0.084（p<0.05）；

10、以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因， NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中野生型與突變型 c.4547C>A，c.5280_5281delTG， c.5540-5541insCCAG， c.5621_5622delGG SCN1A基因mRNA相對(duì)表達(dá)量分別1.014±0.173，0.079±0.02（p<0.05），0.3±0.072（p<0.05），0.299±0.075（p<0.05），0.232±0.034（p<0.05）。
　　結(jié)論：