建立遺傳性SCN1A基因突變家系疾病模型的研究.pdf

1、SCN1A（sodium channel, voltage-gated, type I, alpha subunit）基因編碼電壓門控鈉離子通道Nav1.1的α亞基。目前，已報道的SCN1A基因突變大約1250個，常導(dǎo)致一系列癲癇類疾病。大約70％～80%的Dravet綜合征患者有SCN1A基因的突變，但是其中的發(fā)病機制尚未完全清楚，獲得安全可靠的疾病模型是科學認識疾病的前提。隨著誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent

2、stem cell, iPS）技術(shù)的發(fā)展，這一問題得到解決。iPSCs具有與胚胎干細胞相似的自我更新和多能性的特點，為建立疾病模型、探討發(fā)病機制、藥物篩選以及細胞治療提供了研究基礎(chǔ)，同時未涉及倫理學和自身免疫的問題。目前采用非整合性的iPS技術(shù)避免了外源基因隨機整合。
　　目的:
　　通過對不同材料進行基因外顯子測序，了解家系 SCN1A基因的突變情況，指導(dǎo)臨床遺傳咨詢。利用 iPS和體外定向分化技術(shù)，建立遺傳性無外源基因整

3、合的SCN1A基因突變家系疾病模型，初步探討發(fā)病機制，為后續(xù)深入致病機理，進行藥物篩選和細胞治療提供研究基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.對家系成員的外周血和皮膚成纖維細胞，進行SCN1A基因26個外顯子及上下游100bp內(nèi)含子的基因組測序。
　　2.將先證者及其父親的成纖維細胞通過Episomal質(zhì)粒進行電轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)得到各自的iPS細胞，建立患者特異的iPS細胞系，并對其進行多能性的相關(guān)檢測。
　　3.利用體外定向分化

4、的技術(shù)，將患者特異的 iPS細胞系體外分化成為成熟且有功能的神經(jīng)元，并通過免疫熒光染色對其鑒定。
　　4.通過對成熟的神經(jīng)元進行電生理檢測、外顯子表達水平檢測及測序，初步分析患者SCN1A基因突變導(dǎo)致Dravet綜合征的機制。
　　結(jié)果:
　　1.家系中有三個成員SCN1A基因均有c.4284+2T>C突變，且為雜合突變。
　　2.先證者父親外周血來源的測序結(jié)果顯示SCN1A基因有c.4284+2T>C突變，但是

5、成纖維細胞來源的結(jié)果未發(fā)現(xiàn)此突變。
　　3.利用先證者及其父親的成纖維細胞誘導(dǎo)出 iPSCs，過程中克隆發(fā)出的熒光漸漸消失表明無外源基因插入。
　　4.各建立了十余株細胞系。熒光定量PCR結(jié)果顯示iPS細胞系中多能性基因OCT4、SOX2、KIF4、c-MYC、NANOG、REX1、DPPA4、FGF4和GDF3表達水平高；AP染色為強陽性；免疫熒光染色結(jié)果顯示，均能夠表達干細胞多能性標志物OCT4、SOX2和NANOG，以

6、及細胞表面標志物SSEA3、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81；具有正常核型；裸鼠體內(nèi)形成的畸胎瘤可分化為三個胚層。
　　5. iPSCs在體外分化成為神經(jīng)元，免疫熒光染色表達神經(jīng)元的標志物 TUJ1和MAP2，vGLUT、GABA以及突觸蛋白標志物SYNAPSIN。RT-qPCR結(jié)果表明先證者神經(jīng)元跨21號外顯子上下游區(qū)域表達水平稍低，測序結(jié)果顯示21號外顯子缺失。
　　6.電生理檢測先證者體外分化成熟的神經(jīng)元

7、，發(fā)現(xiàn)具有鈉離子電流，鈉離子通道失活曲線以及激活曲線均向去極化方向偏移。
　　結(jié)論:
　　1. SCN1A基因中c.4284+2T>C突變?yōu)檫z傳性雜合突變。
　　2. SCN1A基因存在嵌合突變的現(xiàn)象，臨床取樣時不應(yīng)局限于外周血測序檢查。唾液、口腔黏膜、毛發(fā)、尿液均可用于臨床診斷，避免錯過可能的突變或者嵌合現(xiàn)象。
　　3.通過 Episomal質(zhì)粒電轉(zhuǎn)誘導(dǎo) iPS技術(shù)，成功建立了無外源基因整合的 SCN1A突變家

8、系iPS細胞系，且均具有良好的多能性。
　　4.利用 iPS技術(shù)及定向分化技術(shù)，獲得了有功能的病人特異性神經(jīng)元細胞，成功在體外建立了Dravet綜合征疾病研究模型。
　　5. SCN1A基因c.4284+2T>C突變造成21號外顯子缺失，影響編碼電壓門控鈉離子通道Nav1.1的α亞基DIII功能域S5跨膜片段，以及S5與S6之間的胞外連接環(huán)，使通道孔壁受損以及離子選擇障礙，導(dǎo)致電壓門控鈉離子通道失活延遲，激活加快，引起神經(jīng)元