利用TALEN技術(shù)向人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞引入癲癇相關(guān)SCN1A基因突變.pdf

1、嬰幼兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇(SMEI)也被稱(chēng)作Dravet氏綜合征，是一種難以治療的癲癇病。嬰幼兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇有許多復(fù)雜的病癥，如:嚴(yán)重的難治性癲癇癥狀，伴隨發(fā)病的共濟(jì)失調(diào)和認(rèn)知障礙。并且嬰幼兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇對(duì)典型的抗癲癇痙攣的藥物治療都有抵抗作用。多年的研究證明，這種癲癇的遺傳病因是鈉通道的突變。而且由SCN1A基因編碼的電壓門(mén)控型鈉離子通道的α亞基是最常見(jiàn)的突變發(fā)生位點(diǎn)。已經(jīng)在嬰幼兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇病人發(fā)現(xiàn)了不同類(lèi)型的SCN1A基

2、因突變包括:無(wú)義突變，移碼突變，錯(cuò)義突變，這些突變發(fā)生在SCN1A基因的不同位置。一些研究團(tuán)隊(duì)提出這樣的假設(shè):癲癇病癥的嚴(yán)重程度是由突變發(fā)生在SCN1A基因上的位置決定的。然而，至今癲癇的疾病表型與基因型之間的聯(lián)系仍然不確定。一些關(guān)于癲癇的發(fā)病機(jī)理的研究表明:引起嬰幼兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇(SMEI)的基因突變會(huì)導(dǎo)致突變鈉離子通道功能的喪失，表現(xiàn)為內(nèi)向鈉電流顯著地減小甚至電流的完全消失?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)提出假設(shè):這種減小的鈉電流會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)的

3、超興奮和導(dǎo)致癲癇相關(guān)的痙攣。并且在動(dòng)物模型上的研究結(jié)果也與這個(gè)假設(shè)相符并一致表明那些引起鈉通道功能喪失的突變都會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷氨基丁酸(GABA)能抑制性中間神經(jīng)元的鈉電流，從而導(dǎo)致了嬰幼兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇(SMEI)的超興奮。關(guān)于嬰幼兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇(SMEI)的分子致病機(jī)理仍需要進(jìn)一步的研究。
　　TALEN是基因工程中一個(gè)重要的高效的工具，它可以在活細(xì)胞的基因組的特異的基因序列上切出缺口。TALEN主要是由兩部分組成的。一部分是

4、轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)器(TAL)，它是一種黃單胞菌屬的植物病原細(xì)菌的毒力因子。這種轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)器(TAL)的原始功能就是在通過(guò)細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)侵染進(jìn)入宿主細(xì)胞后破壞宿主細(xì)胞原有的基因調(diào)控系統(tǒng)并且與效應(yīng)器特異性識(shí)別的基因組序列結(jié)合。TALEN的另一部分是FokI核酸酶，它可以有效地切割識(shí)別的DNA序列，由于可以在體內(nèi)特異性地創(chuàng)造出雙鏈的DNA斷裂缺口(DSBs)，從而被用于基因操作。由于FokI核酸酶只有在二聚體的狀態(tài)下才能切割DNA，所以這些T

5、AL效應(yīng)器的核酸酶(TALENs)在切割DNA缺口時(shí)也是成對(duì)發(fā)生作用的。然而這些在細(xì)胞里的雙鏈缺口(DSBs)可以通過(guò)細(xì)胞自身的非同源性末端接合(NHEJ)進(jìn)行修復(fù)，但非同源性末端接合(NHEJ)會(huì)損傷打靶基因?qū)胄∑蔚牟迦牒腿笔?。這些雙鏈缺口(DSBs)也可以通過(guò)同源重組(HR)進(jìn)行修復(fù)，但這需要一個(gè)同源的DNA片段作為模版去復(fù)制跨過(guò)缺口的信息，這種修復(fù)可以被用作基因的插入和替換。
　　到目前為止，科學(xué)家在研究神經(jīng)退行性疾病上

6、遇到了許多困難。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)技術(shù)可以將人體細(xì)胞人工地重編程到一種多能性的狀態(tài)，然后可以將這些多能性的細(xì)胞分化成幾乎任何類(lèi)型的與疾病相關(guān)的細(xì)胞、組織，所以它為體外神經(jīng)疾病的建模提供了幾乎無(wú)限的疾病相關(guān)的、病人特異性的成體細(xì)胞。同時(shí)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)技術(shù)可以避開(kāi)與胚胎干細(xì)胞(ES)相關(guān)的倫理道德問(wèn)題以及潛在的同種異體的免疫排斥問(wèn)題?？傊c疾病相關(guān)的基因修復(fù)的病人特異性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的獲得是生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開(kāi)

7、發(fā)領(lǐng)域的一個(gè)重大進(jìn)展。
　　通常，我們會(huì)拿病人來(lái)源的疾病相關(guān)的細(xì)胞系和一株正常人的細(xì)胞系作比較，然而這種比較存在很大的缺陷。一方面，神經(jīng)退行性疾病在體內(nèi)通常都有一個(gè)較長(zhǎng)的潛伏期和一個(gè)緩慢的細(xì)胞病變過(guò)程，而且大部分都是晚年才發(fā)病的。更重要的是，在體外這些疾病的表型都很微弱。另一方面，這兩株細(xì)胞系不同的基因背景也為體外研究增加了一個(gè)很大的阻礙，因?yàn)槿魏挝覀冇^察到的這兩株細(xì)胞系的區(qū)別都不能被定義成到底是疾病相關(guān)的損傷還是因?yàn)椴煌倪z傳背

8、景。所以，要從不可預(yù)知的遺傳背景變化中區(qū)別這些微弱的但是與疾病相關(guān)的表型變化是很困難的，這需要更嚴(yán)格的使遺傳背景相匹配的研究方法。
　　因此，為了建立一個(gè)遺傳背景確定的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)去研究癲癇的治病機(jī)理，我們做的工作主要包括:
　　1、獲得了一株正常人來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞株(iPSCs)，這株誘導(dǎo)多能干細(xì)胞株是由皮膚成纖維細(xì)胞重編程獲得的并且擁有正常的基因型。然后我們?cè)O(shè)計(jì)了打靶SCN1A基因的TALEN，并且對(duì)這株干細(xì)胞的內(nèi)源性基

9、因組(SCN1A)進(jìn)行了基因修飾。結(jié)合iPSC和TALEN技術(shù)，我們突變了正常人來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的SCN1A基因，引入了點(diǎn)突變A5768G，于是我們成功構(gòu)建了一株“人造病人”細(xì)胞株。
　　2、同時(shí)，我們獲得了病人來(lái)源的皮膚成纖維細(xì)胞，利用重編程技術(shù)將這株細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，并利用TALEN技術(shù)，對(duì)引起疾病的基因突變進(jìn)行修復(fù)，構(gòu)建了一株“突變修復(fù)”細(xì)胞株。
　　3、基因修復(fù)后，我們檢測(cè)了各細(xì)胞株的多能性。證明這些iPS

10、細(xì)胞株都保持了多能性。
　　4、并且將這些iPS細(xì)胞系成功分化成有功能的神經(jīng)元。
　　基于以上所有的工作，我們將研究正常人來(lái)源的細(xì)胞系和構(gòu)建的“人造病人”細(xì)胞系以及病人來(lái)源的細(xì)胞株和疾病修復(fù)的細(xì)胞株，這種情況下，我們感興趣的與疾病相關(guān)的基因病變將是唯一的變量。這種技術(shù)可以成功地對(duì)iPS細(xì)胞進(jìn)行疾病相關(guān)的基因操作，并為研究癲癇的治病機(jī)理和藥物篩選建立了細(xì)胞模型。因此我們希望可以做出更準(zhǔn)確更可信的關(guān)于致病機(jī)理的闡述，甚至是對(duì)癲癇