SCN1A基因突變導(dǎo)致部分性癲癇伴熱性驚厥附加癥：分子特征與表型-抗癲癇藥物反應(yīng)及其分子致病機(jī)制.pdf

1、【目的】熱性驚厥相關(guān)癲癇是涵蓋了由一系列由輕到重表型的復(fù)雜癲癇譜系，并與SCN1A基因突變密切相關(guān)。既往曾報道熱性驚厥相關(guān)部分性癲癇的患者，其表型相對溫和，但臨床上具有鈉通道阻滯類抗癲癇藥物（AEDs）加重發(fā)作的現(xiàn)象，基因檢測發(fā)現(xiàn)SCN1A基因突變。這類癲癇被稱之為部分性癲癇伴熱性驚厥附加癥（PEFS+）。然而，有關(guān)PEFS+的臨床特征、SCN1A基因突變特征以及抗癲癇藥物反應(yīng)目前尚未明晰。為此，本研究將對PEFS+中SCN1A基因檢測

2、陽性的患者進(jìn)行臨床特征、藥物療效和突變分子特征的分析，并與在Dravet綜合征（DS）和遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥（GEFS+）SCN1A篩查陽性的患者進(jìn)行比較分析，從而探討SCN1A突變相關(guān)PEFS+基因型-表型-AEDs反應(yīng)之間的關(guān)系及其獨(dú)特性。結(jié)果將豐富熱性驚厥相關(guān)癲癇的臨床診治體系，為臨床基因個體化診治提供有力證據(jù)。此外，SCN1A剪切位點(diǎn)突變絕大多數(shù)發(fā)生于DS等嚴(yán)重表型中，但在表型溫和的 PEFS+患者中也被報道，但其對 PE

3、FS+潛在分子致病機(jī)制仍未清楚。本研究通過異源細(xì)胞體 minigene體外報告的方法，研究 PEFS+相關(guān) SCNA剪切位點(diǎn)突變體的體外mRNA剪切模式，并與Dravet綜合征等嚴(yán)重表型比較，探討其潛在的分子致病機(jī)制，以及剪切模式與表型-基因型-遺傳模式間的關(guān)系。其結(jié)果將從分子水平為SCN1A基因?qū)Πd癇的致病機(jī)制及其他基因的功能研究提供有效的研究方法和證據(jù)支持。
　　【方法】
　　一、PEFS+相關(guān)SCN1A基因突變的基因型

4、-表型-AEDs反應(yīng)關(guān)系
　　1.直接測序和焦磷酸測序進(jìn)行SCN1A基因點(diǎn)突變和嵌合突變篩查；
　　2.生物信息學(xué)技術(shù)分析PEFS+相關(guān)SCN1A基因突變致病性；
　　3.與本研究在Dravet綜合癥（DS）、遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥（GEFS+）&熱性驚厥附加征（FS+）上篩查到的SCN1A突變進(jìn)行突變類型、遺傳方式和錯義突變氨基酸置換差異值（D值）的比較；
　　4.與SCN1A突變數(shù)據(jù)庫有關(guān)DS、GEFS+

5、& FS+/FS的數(shù)據(jù)進(jìn)行上述突變分子特征的比較；
　　5.分析SCN1A突變PEFS+的表型特征，并與本研究的SCN1A突變DS、GEFS+& FS+/FS患者的臨床特征進(jìn)行比較；
　　6.分析SCN1A突變相關(guān)PEFS+的AEDs治療反應(yīng)，探討表型-基因型-藥物反應(yīng)關(guān)系。
　　二、PEFS+相關(guān)SCN1A基因剪切位點(diǎn)突變的體外剪切分析
　　1.運(yùn)用報告minigene，構(gòu)建pTragetE2-3-4-5及E2

6、4-25-26野生型質(zhì)粒載體，對PEFS+及對照的Dravet綜合征相關(guān)剪切位點(diǎn)突變進(jìn)行分子克隆；
　　2.運(yùn)用HENK293細(xì)胞體外表達(dá)和RT-PCR法，分析各突變體的體外剪切形式；3. Q-PCR分析SCN1A基因突變后mRNA轉(zhuǎn)錄本的相對表達(dá)量。
　　【結(jié)果】
　　一、SCN1A基因突變相關(guān)PEFS+的基因型-表型-AEDs反應(yīng)關(guān)系
　　1.238例PEFS+患者有26例（10.9％）發(fā)現(xiàn)了SCN1A基因雜

7、合突變，共27個突變位點(diǎn)，其中各有3人為截短突變（11.5%）和剪切位點(diǎn)突變（11.5%）；19個患者為錯義突變（73.1%），其中1人攜帶2個突變；余1人為框內(nèi)缺失（3.8%）。25個驗(yàn)證父母來源的突變中，64%為新生突變；遺傳突變（36%）中2個來自父親的嵌合突變。
　　2. PEFS+相關(guān)截短突變均位于遠(yuǎn)離SCN1A基因終止密碼子的序列上游；剪切位點(diǎn)突變經(jīng)剪切分析軟件提示可能導(dǎo)致不同程度的mRNA異常剪切；錯義突變和框內(nèi)缺失

8、突變位點(diǎn)85%處于高度保守序列。錯義突變中11個位于Na v1.1通道的關(guān)鍵功能區(qū)（55%），其中孔區(qū)10個（50%），具有較低的D值，與9個（45%）位于非關(guān)鍵功能區(qū)的錯義突變D值相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.019）；框內(nèi)缺失突變也位于孔區(qū)。
　　3.與本研究DS和GEFS+& FS+/FS的突變特征相比，PEFS+在突變類型、遺傳特征以及錯義突變的分子特征上均介于二者之間，雖差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但相關(guān)分析提示表型的嚴(yán)重程度與

9、錯義突變在關(guān)鍵功能區(qū)的比例及新生突變的比例呈正相關(guān)。
　　4.與SCN1A突變數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)比較再次確認(rèn)，PEFS+在突變類型的分布、遺傳特征以及錯義突變的分子特征上均介于DS和GEFS+之間，且在錯義突變和截短突變的比例、錯義突變關(guān)鍵功能區(qū) D值上，PEFS+與 DS比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在遺傳突變的比例上，PEFS+與DS和GEFS+& FS+/FS比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.SCN1A突變PEFS+患者平均起病年齡于

10、9±3.0月（FS：9±5.7月，無熱發(fā)作：24±21月），發(fā)作頻率FS和aFS(GTCS)分別為5.5±2.5和4.5±2.0次/年，所有患者恰當(dāng)AEDs治療均獲得發(fā)作緩解，其中23.1%無發(fā)作，53%患者可出現(xiàn)輕-中度智能發(fā)育遲緩。在起病年齡、發(fā)作頻率、發(fā)作預(yù)后及發(fā)育預(yù)后方面PEFS+均介于DS和GEFS+& FS+/FS之間，且不論與典型或邊緣型DS相比差異均有意義。
　　6. SCN1A突變的PEFS+患者AEDs的治療效

11、果與DS相似，15例患者曾使用鈉通道阻滯類 AEDs，治療效果均不佳，70%患者發(fā)作加重。這些患者中86.7%攜帶致病性較強(qiáng)的突變。
　　二、PEFS+相關(guān)SCN1A基因剪切位點(diǎn)突變的體外剪切分析
　　1. RT-PCR顯示相比對照組DS突變體均外顯子刪除，PEFS+突變體出現(xiàn)2種類型的 mRNA異常剪切，即外顯子刪除和內(nèi)含子插入；相比 DS突變體未見明確正常mRNA轉(zhuǎn)錄本，PEFS+突變體的正常和異常mRNA轉(zhuǎn)錄共存。

12、r>　　2.定量PCR顯示PEFS+突變體c.473+5G>A和c.473+5G>C異常和正常轉(zhuǎn)錄mRNA相對量（RQ）分別為（4.92±1.05%，6.10±0.21%）和（7.97±1.12%，3.94±1.25%），與對照組 DS突變體 c.602+1G>A比較（異常和正常 mRNA的RQ分別為60.51±1.81%和0.06±0.022%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；PEFS+突變體 c.4853-25T>A正常與異常轉(zhuǎn)錄 mRNA的

13、RQ分布為71.22±11.92%和7.38±1.61%，與對照組DS突變體c.4853-1G>C比較（正常和異常mRNA相對量分別為0.08±0.01%和22.11±2.83%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.結(jié)合剪切突變點(diǎn)的位置進(jìn)行分析，深部內(nèi)含子區(qū)的突變?yōu)檫z傳突變，異常剪切方式為內(nèi)含子插入，正常 mRNA轉(zhuǎn)錄本量遠(yuǎn)高于異常轉(zhuǎn)錄本，為臨床表現(xiàn)最輕的PEFS+；可變剪切位點(diǎn)和固有剪切位點(diǎn)突變均為新生突變，異常剪切方式均為外顯子刪除

14、，但前者正常轉(zhuǎn)錄本量與異常轉(zhuǎn)錄本近似，臨床為相對溫和的PEFS+，后者則異常轉(zhuǎn)錄本量遠(yuǎn)高于正常轉(zhuǎn)錄本，臨床對應(yīng)嚴(yán)重表型DS。
　　【結(jié)論】
　　1. SCN1A基因是PEFS+的重要致病基因，并表現(xiàn)出與PEFS+溫和表型相關(guān)的弱致病性。
　　2.PEFS+無論在臨床特征，還是SCN1A基因突變分子特征、遺傳模式上，都是介于DS和GEFS+之間的獨(dú)立中間型。
　　3.鈉通道阻滯類AEDs可加重PEFS+的發(fā)作，SC