遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥鉀通道致病基因捕獲驗證和海馬氫質(zhì)子波譜改變.pdf

1、遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥(Genetic epilepsy with febrile seizures plus，GEFS+)是一個以常染色體顯性遺傳為主的癲癇綜合征，其基因型和表型具有很大的異質(zhì)性。目前已知的致病基因主要是鈉離子通道基因，仍有很多致病基因不明，很多未知致病基因或易感基因需進一步發(fā)掘和探索。本研究主要對于GEFS+家系鉀通道致病基因研究，應用二代測序加目標基因靶向捕獲對鉀通道基因捕獲、然后進行相關功能驗證，尋找GEFS

2、+的致病基因，繼而探討GEFS+與海馬氫質(zhì)子波譜(～H Magnetic resonance spectroscopy,MRS)改變的關系。
　　研究對象及方法:
　　收集2012年1月～2016年12月就診于廣東省人民醫(yī)院小兒癲癇?？崎T診及病房GEFS+患兒，據(jù)2001年國際抗癲癇聯(lián)盟(ILAE)的癲癇及癲癇綜合征的診斷標準和GEFS+定義。收集14個GEFS+家系，先證者14人及家系成員共48人，行二代測序加癲癇目標基因

3、靶向捕獲技術(shù)檢測。在一個GEFS+家系發(fā)現(xiàn)KCNQ4基因的錯義突變(P537S)，應用以上技術(shù)再在另13個GEFS+家系和26個熱性驚厥(Febrileseizures，F(xiàn)S)先證者及家系驗證，通過Sanger測序?qū)Πl(fā)現(xiàn)的KCNQ4突變位點在200例健康人群驗證。選取KCNQ4P537S構(gòu)建質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細胞，通過熒光定量PCR比較KCNQ4P537S與KCNQ4野生型組(WT) mRNA水平，Western blot比較K

4、CNQ4P537S與KCNQ4WT蛋白水平，構(gòu)建Kv7.4 P537S純合及Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT雜合通道，再通過全細胞膜片鉗檢測Kv7.4 P537S電流與野生型的差異。
　　在此基礎上，14例GEFS+先證者行海馬MRS檢查，計算雙側(cè)海馬NAA/Cr、Cho/Cr、NAA/(Cho+Cr)值與對照組比較。
　　結(jié)果:
　　1.在14個GEFS+家系中，發(fā)現(xiàn)一個KCNQ4基因突變c.1609C＞T，

5、位于外顯子12上，可導致蛋白質(zhì)發(fā)生如下變異:p.Pro537Ser（脯氨酸→絲氨酸）。另26個FS家系驗證中又發(fā)現(xiàn)KCNQ4兩個突變:c.1177G＞T、c.1207G＞A位于外顯子9上，可分別導致以下蛋白質(zhì)變異:p.Gly393Cys（甘氨酸→半胱氨酸），p.Ala403Thr（丙氨酸→蘇氨酸）。每個病人僅攜帶其中一個突變。以上位點國內(nèi)外未見報道。
　　2.GEFS+家系外及健康人群驗證未發(fā)現(xiàn)以上突變。
　　3.熒光定量P

6、CR: KCNQ4 P537S mRNA相對于KCNQ4WT表達量為0.776852，二組mRNA表達量差異比較p值0.1，差異無統(tǒng)計學意義。
　　4.Western blot: KCNQ4 P537S蛋白表達量相對于KCNQ4WT蛋白表達量，二組比較差異p值0.0289，差異有統(tǒng)計學意義。
　　5.膜片鉗:細胞膜電壓鉗制于-90mV,階躍刺激從-70mV開始至+60mV，步階10mV，Kv7.4 P537S和Kv7.4 W

7、T組、Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT組和Kv7.4WT/Kv7.3 WT組鉀離子通道約在電壓-70mv開放，當電壓達到50mV左右時通道電流達到峰值，Kv7.4 P537S組電流密度為13.27±2.144 pA/pF(n=10)，Kv7.4WT電流密度為25.8±4.147 pA/pF（n=8），二者比較p值0.0116，差異有統(tǒng)計學意義。Kv7.4 P537S組的I-V曲線較Kv7.4 WT組右移。Kv7.4 P537S/

8、Kv7.3 WT組電流密度為32.15±2.622 pA/pF(n=8)，Kv7.4 WT/Kv7.3 WT電流密度為61.69±9.225 pA/pF(n=10)，二者比較p值0.0135，差異有統(tǒng)計學意義。Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT組I-V曲線較Kv7.4 WT/Kv7.3WT組右移。Kv7.4 WT的激活曲線V50為14.3mv，而Kv7.4 P537S為11.3mv，二者比較差異無統(tǒng)計學意義。Kv7.4WT/Kv7

9、.3 WT組V50為3.485mv，而Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT為9.955mv，二者比較差異有統(tǒng)計學意義，而且Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT激活曲線右移。
　　6.本研究GEFS+患兒雙側(cè)海馬波譜NAA/（Cr+Cho）平均值0.71±0.11，正常對照組0.74±0.10，p值0.214，差異無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　1.發(fā)現(xiàn)一個GEFS+家系KCNQ4基因突變c.1609C＞T，另2

10、6個FS家系驗證中發(fā)現(xiàn)KCNQ4兩個突變:c.1177G＞T、c.1207G＞A。
　　2.KCNQ4P537S影響了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。
　　3.膜片鉗結(jié)果顯示KCNQ4P537S對細胞膜電位產(chǎn)生影響，電流密度下降，細胞膜上離子通道開放的數(shù)目減少，細胞膜復極過程延長，對神經(jīng)元興奮活動抑制下降，從而引起神經(jīng)元興奮性增高，引起癲癇的發(fā)生。
　　4.KCNQ4可能是中國人群GEFS+的新的突變基因。
　　5.本研究G