GDNF截短異構體胞內運輸及分泌的機制研究.pdf

1、目的：膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）是一類調節(jié)神經(jīng)元存活和分化的蛋白質，研究表明GDNF對多巴胺能神經(jīng)元有保護作用，因而引起了人們對其治療帕金森病的極大興趣。GDNF能促進多巴胺能神經(jīng)元形態(tài)分化，使神經(jīng)元胞體增大、軸突延長。GDNF還對損傷后的中腦多巴胺能神經(jīng)元有明顯作用。GDNF在大鼠腦中的表達主要見于中腦黑質神經(jīng)元的靶細胞，如紋狀體、伏核、丘腦核、嗅結節(jié)、海馬、小腦、扣帶回和嗅球的內顆粒細胞，具有靶源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用。GD

2、NF通過與其特異的受體結合，將其生物信號傳導至細胞內而發(fā)揮相應的生物學效應：細胞膜外蛋白GFRs（GFRα1—GFRα4）與特異的GDNF家族成員結合后，才能激活作為公用受體的酪氨酸受體激酶Ret，從而發(fā)揮信號轉導的作用。即GDNF作用于多巴胺能神經(jīng)元上的受體GFRα1或GFRα2，通過一系列信號轉導機制，刺激早期基因編碼產(chǎn)生有生物活性的因子，起到穩(wěn)定細胞內Ca2+等其他離子的作用，從而阻止6—羥多巴胺引起的多巴胺能神經(jīng)元的損傷。因此，

3、GDNF家族神經(jīng)營養(yǎng)因子在體內能預防多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變，這一點對于治療多巴胺代謝紊亂性疾病如帕金森氏病等方面，具有重要的臨床意義。 GDNF是一個含有二硫鍵的同源二聚體分泌性蛋白質，其前蛋白含有18個氨基酸殘基的信號序列肽，首先合成的是含有211個氨基酸的前體蛋白稱為proGDNF，蛋白加工后的成熟蛋白含有134個成熟殘基，含有兩個糖基化位點，蛋白質水解的同源性序列定位于exonⅡ。最近文獻報道GDNF前體在細胞內轉運

4、和分泌過程中起到了重要的作用。在特定的某些人群種及嚙齒類動物中GDNF前體cDNA序列與文獻報道的633bp的序列相比缺失了78個堿基（GDNF△78），這78個堿基的缺失并不產(chǎn)生框移突變，目前我們對GDN△78知之甚少，因此78個堿基的缺失是否影響人GDNF蛋白的分泌及其活性是本項研究的主要目的。不同的生長因子，如神經(jīng)營養(yǎng)素家族（NTs）、胰島素樣生長因子（IGF—1）、膠質源性神經(jīng)生長因子（GDNF）等在神經(jīng)細胞中通過結構性分泌參與

5、神經(jīng)元的存活、生長、分化、神經(jīng)再生、突觸形成。GDNF△78對GDNF的加工、運輸和分泌是否有影響并未明確，我們通過免疫熒光和Westrn blot的方法研究GDNF△78在神經(jīng)細胞中的定位及其分泌機制。 方法： 1．在PC12細胞中檢測GDNF△78和GDNF FL對分泌的影響：將GDNF△78和GDNF FL轉染PC12細胞，利用Western blot的方法檢測他們在細胞中的表達，并且建立檢測細胞的組成型及調節(jié)型分

6、泌（高K+）的方法，研究二者在不同分泌途徑中的差異，采用ELISA進一步證實Western blot的結果，檢測GDNF△78和GDNF FL在組成性分泌和調節(jié)性分泌中的不同。 2．GDNF△78和GDNF FL在神經(jīng)元中的運輸：利用C—末端標記HA標簽的質粒轉染神經(jīng)元細胞，用HA和神經(jīng)元樹突標志物MAP2雙染觀察免疫熒光，判斷分泌情況。 3．確定GDNF△78異常的運輸途徑：利用TGN38抗體共定位的方法，確定GDNF

7、△78在高爾基體和內質網(wǎng)中分泌和轉運情況。 結果： 1．Western blot顯示GDNF△78和GDNF FL表達量相同而且均含有前體蛋白和成熟結構。GDNF ELISA結果證實了GDNF△78在結構性分泌和調節(jié)性分泌中與GDNF FL相比均有較明顯的降低。 2．免疫熒光顯示GDNF△78在PC12細胞和神經(jīng)元細胞中聚集在胞體部位的量高于GDNF FL。 3．免疫共定位顯示GDNF△78與GDNF F