MRNA-145負向調(diào)控catenin-δ1抑制胃癌浸潤的機制研究.pdf

1、目的:
　　本研究中將進一步驗證miR-145能否調(diào)控CTNND1的表達及其定位，研究CTNND1與cadherin家族成員的作用關系，并深入探討其調(diào)控的分子機制。此外，我們還將構建裸鼠成瘤模型，在體內(nèi)進一步驗證CTNND1的表達及定位與胃癌浸潤的關系。
　　方法:
　　1.本研究對126例臨床胃癌標本和50例非腫瘤胃黏膜組織進行免疫組化方法檢測CTNND1的表達和觀察其細胞定位情況，并進一步分析其表達和定位與臨床病理

2、參數(shù)的關系。
　　2.利用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗對兩組胃癌患者（陰性與陽性，膜定位與漿定位）的總體生存率和無瘤生存率進行統(tǒng)計分析，探討CTNND1的表達及其定位與胃癌患者生存率的關系。
　　3.通過Cox比例風險回歸模型單因素和多因素統(tǒng)計分析，進一步驗證CTNND1漿定位能否作為預測胃癌患者預后的獨立危險因素。
　　4.構建CTNND1過表達和siRNA質粒，將CTNND1

3、cDNA和CTNND1 siRNA質粒分別轉染細胞，使CTNND1的表達上調(diào)和下調(diào)，然后驗證其生物學功能。通過Transwell小室，MTS實驗，流式細胞技術檢測CTNND1的表達對細胞遷移和浸潤能力、增殖和凋亡作用的影響。
　　5.實時定量PCR檢測胃癌組織中miR-145的表達情況，評估m(xù)iR-145與總體CTNND1的陽性表達率是否存在相關性。同時擴增CTNND13'-UTR區(qū)序列，構建pmirGLO熒光素酶載體，通過雙熒光

4、報告系統(tǒng)檢測和western blot分析驗證CTNND1是否受到miR-145的調(diào)控。
　　6.對臨床樣本中miR-145與膜定位和漿定位的CTNND1的陽性表達率分別進行相關性分析，驗證miR-145對CTNND1定位是否具有調(diào)節(jié)作用。轉染miR-145和miR-control,通過細胞免疫熒光技術和western blot實驗，觀察CTNND1，E-cadherin和N-cadherin的表達及細胞定位的情況。進行N-cad

5、herin siRNA轉染，利用細胞免疫熒光技術和western blot實驗探討N-cadherin在miR-145調(diào)控CTNND1表達和定位中的作用，進一步闡明miR-145調(diào)控CTNND1漿定位抑制胃癌浸潤的分子機制。
　　7.將轉染慢病毒表達載體pEZX-miR-145及pEZX-miR-control的腫瘤細胞注射到裸鼠體內(nèi)，構建成瘤模型。6周后取出裸鼠中瘤體組織，測量兩組裸鼠瘤體組織的直徑，并對瘤體切片進行H&E和CT

6、NND1免疫組化染色，觀察兩組腫瘤組織浸潤和CTNND1定位的情況，體內(nèi)進一步驗證CTNND1定位與胃癌浸潤的關系。
　　結果:
　　1.免疫組化結果顯示:在非腫瘤胃黏膜組織中，CTNND1定位于細胞膜。相比非腫瘤胃黏膜組織，CTNND1在胃癌組織中表達上調(diào)。CTNND1在胃癌組織中的表達有細胞膜和細胞漿兩種定位形式，尤以漿定位居多。CTNND1的總體陽性表達只與胃癌的分化程度和Lauren分型相關，與其它臨床病理參數(shù)無密切

7、聯(lián)系。而漿表達的CTNND與胃癌的臨床分期、T分期、淋巴結和遠處轉移及Lauren分型情況密切相關。
　　2.Kaplan-Meier生存曲線顯示胃癌患者的總體生存時間和無瘤生存時間與CTNND1的定位密切有關，而與CTNND1的總體表達情況無關。CTNND1漿定位的腫瘤患者生存期更短，預后更差。
　　3.通過Cox回歸模型單因素統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)漿定位CTNND1，UICC臨床分期，T分期，淋巴結轉移和遠處轉移都是影響胃癌患者

8、預后的危險因素。多因素統(tǒng)計分析表明漿定位CTNND1是預測胃癌患者預后的獨立危險因素。
　　4.CTNND1 cDNA質粒轉染48h后與Mock control組相比，胃癌細胞SGC7901的遷移和浸潤顯著增加，同時CTNND1 siRNA轉染后SGC7901的遷移和浸潤能力又明顯下降。MTS實驗和流式細胞檢測結果顯示CTNND1的表達下調(diào)后對胃癌細胞的增殖和凋亡沒有顯著的作用。
　　5.本研究結果顯示miR-145的表達與

9、CTNND1的陽性表達率存在負相關。熒光素酶實驗結果發(fā)現(xiàn)miR-145和CTNND1-pmirGLO載體共轉染組細胞的熒光強度明顯低于對照組。轉染miR-145后，western blot實驗結果顯示CTNND1蛋白表達明顯下調(diào)。以上結果均提示CTNND1是miR-145調(diào)控的直接靶基因。
　　6.相關性分析顯示miR-145的表達與漿定位CTNND1的表達存在顯著的負相關，提示miR-145可能參與了CTNND1定位的調(diào)節(jié)。細胞

10、免疫熒光實驗顯示:miR-control轉染組的細胞CTNND1主要定位于細胞漿，而miR-145轉染組細胞CTNND1定位于細胞膜上。本研究進一步表明miR-145介導了CTNND1由細胞漿向細胞膜定位的改變。隨后我們又檢測了N-cadherin和E-cadherin的定位情況，發(fā)現(xiàn)與miR-control組相比，miR-145轉染組細胞N-cadherin蛋白表達有所降低（熒光強度降低但定位沒有改變），同時E-cadherin的定位

11、也由細胞漿轉變?yōu)榧毎ど稀檫M一步判斷N-cadherin在CTNND1和E-cadherin的定位改變的作用，我們將N-cadherin siRNA轉染的細胞進行免疫熒光實驗，結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，N-cadherin siRNA轉染組的細胞CTNND1和E-cadherin的表達也出現(xiàn)了膜定位的改變，這說明miR-145介導的CTNND1和E-cadherin定位的改變是通過N-cadherin的表達來實現(xiàn)的。Western blo

12、t結果顯示轉染miR-145和N-cadherin siRNA后，CTNND1總蛋白表達下調(diào)，CTNND1膜蛋白表達卻增加，而E-cadherin蛋白的表達量沒有改變。
　　7.動物實驗結果表明pEZX-miR-145及pEZX-miR-control兩組瘤體的大小沒有顯著差異。pEZ×-miR-145組瘤體包膜完整，沒有出現(xiàn)肌肉浸潤的現(xiàn)象，免疫組化結果顯示CTNND1主要定位于細胞膜。而pEZX-miR-control組瘤體包膜

13、不完整，出現(xiàn)了肌肉和血管浸潤的現(xiàn)象，其中CTNND1主要定位于細胞漿。Western blot檢測結果顯示pEZX-miR-145組CTNND1蛋白的表達明顯低于pEZX-miR-control對照組。
　　結論:
　　1.CTNND1在胃癌組織中高表達，且主要定位于細胞漿。CTNND1的漿定位與胃癌的臨床分期、T分期、淋巴結和遠處轉移及Lauren分型情況密切相關。
　　2.相比CTNND1膜定位的胃癌患者，漿定位的

14、胃癌患者生存時間更短，預后更差。漿定位CTNND1可以作為預測胃癌患者預后的獨立影響因子。
　　3.漿定位的CTNND1表達上調(diào)可以增強胃癌細胞遷移和浸潤能力，但對細胞的增殖和凋亡無明顯作用。CTNND1有望成為胃癌治療的靶點。
　　4.CTNND1的表達及定位受到miR-145的調(diào)控。CTNND1表達上調(diào)的原因在于miR-145表達的下調(diào)，CTNND1是miR-145的直接靶基因，miR-145不僅能下調(diào)漿定位CTNND1